百草枯殘留檢測(cè)ELISA試劑盒及百草枯模擬抗體的解毒效果研究.pdf

1、背景：百草枯是時(shí)下世界上應(yīng)用最多的除草劑，對(duì)人和動(dòng)物均有較強(qiáng)毒性。百草枯中毒在臨床中的死亡率極高，目前尚無(wú)明顯有效的救治方法。百草枯中毒的病死率與口服百草枯的量有密切關(guān)系，一般認(rèn)為口服20％百草枯水劑>20 mg/kg即可導(dǎo)致死亡。目前我國(guó)多采用液相-質(zhì)譜聯(lián)用法、紫外分光光度法、毛細(xì)血管電泳法、高效液相色譜法等進(jìn)行檢測(cè)，但這些檢測(cè)方法均需要復(fù)雜的樣品前處理，在前處理過(guò)程中會(huì)丟失部分百草枯，造成檢驗(yàn)結(jié)果的不準(zhǔn)確，且不同樣品的百草枯殘留有各

2、自最佳的檢測(cè)方法，不僅加大了檢測(cè)難度還增加了檢測(cè)費(fèi)用，因此需要建立一種高效、可靠、簡(jiǎn)便的百草枯殘留檢測(cè)方法，指導(dǎo)臨床治療和判斷預(yù)后。 百草枯進(jìn)入人體后通過(guò)炎癥反應(yīng)、氧化損傷等導(dǎo)致各個(gè)器官均受損害，其中嚴(yán)重肺纖維化所致的呼吸衰竭是百草枯中毒最主要的死亡原因，因此減緩肺纖維化的進(jìn)程，降低死亡率，是百草枯中毒治療的關(guān)鍵。目前臨床上首選的治療方法為血液凈化，但血液凈化費(fèi)用昂貴，且研究發(fā)現(xiàn)血液凈化雖然能夠延長(zhǎng)生存時(shí)間,但對(duì)降低病死率的作用不大。所

3、以百草枯中毒的治療方法一直是臨床上的難題，建立規(guī)范、標(biāo)準(zhǔn)、有效的治療方案是急需解決的問(wèn)題。
　　目的：研制一種前處理簡(jiǎn)單、靈敏度高，且能同時(shí)檢測(cè)食物、血液、尿液以及胃液中百草枯殘留的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒，以滿足農(nóng)業(yè)及臨床上的快速檢測(cè)需求；驗(yàn)證百草枯模擬抗體對(duì)百草枯所致急性肺損傷的解毒效果，探討臨床應(yīng)用的可行性。
　　方法：⑴利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，采用間接競(jìng)爭(zhēng) ELISA方法來(lái)檢測(cè)百草枯的殘留。首先合成百草枯完全抗

4、原（PQ-OVA）作為包被原，然后加入目標(biāo)物與固定抗原共同競(jìng)爭(zhēng)抗百草枯抗體，最后加入酶標(biāo)二抗，顯色并終止后讀取OD450值，利用百草枯抗體與百草枯小分子的高度專一性來(lái)推算目標(biāo)物中小分子的含量。⑵建立百草枯中毒大鼠模型，觀察抗百草枯模擬抗體對(duì)百草枯所致的急性肺損傷的解毒作用。首先純化抗百草枯模擬抗體，確保其能夠特異性識(shí)別百草枯小分子。然后建立百草枯中毒大鼠模型，選取6～8周的SPF級(jí)大鼠65只，體質(zhì)量200~250g，隨機(jī)分為3組，其中對(duì)

5、照組15只，染毒組25只，治療組25只，正常飼養(yǎng)條件。對(duì)照組腹腔注射無(wú)菌生理鹽水（NS）1.8 ml/kg；染毒組腹腔注射20%百草枯水劑18 mg/kg，20%百草枯水劑用無(wú)菌生理鹽水稀釋至10 mg/ml后再注射；治療組(PQ抗體組)在PQ中毒2h后立即尾靜脈注射抗PQ模擬抗體(1 mg/kg)，連續(xù)注射等劑量抗體3天。連續(xù)14天觀察各組大鼠的表現(xiàn)和反應(yīng)，并分別于1、3、7、14天時(shí)處死3只大鼠，采血離心檢測(cè)TGF-β1和IL-6的

6、表達(dá)水平，并取左下肺葉于10%甲醛液浸泡后石蠟包埋,做成4μm厚的切片,蘇木精-伊紅染色(H-E染色)后行顯微鏡觀察病理變化，對(duì)比三組的不同點(diǎn)。
　　結(jié)果：①間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA最佳反應(yīng)條件如下：包被抗原和一抗工作濃度分別為2.0μg/ml和1:28000；包被溫度和時(shí)間為4℃14h；封閉液為1% OVA；封閉量為150μl；封閉時(shí)間為45 min；競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)時(shí)間為45 min，二抗作用時(shí)間為30 min，酶標(biāo)二抗?jié)舛葹?:400

7、0；顯色液比例為A/B=1/19；顯色時(shí)間10min。②試劑盒的最低檢測(cè)限即IC10為0.08 ng/ml，線性檢測(cè)范圍為0.16~10.76 ng/ml， IC50為1.32 ng/ml。該試劑盒與敵草快的交叉反應(yīng)率僅為0.01348%.各種樣品添加回收率均高于80%，變異系數(shù)小于14%，板內(nèi)變異系數(shù)在0.24%~9.57%之間，板間變異系數(shù)在1.17%~11.09%之間，結(jié)果表明該ELISA法同國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法相比，其檢測(cè)靈敏度更高

8、。③百草枯模擬抗體成功表達(dá)，經(jīng)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA驗(yàn)證，其具有良好的競(jìng)爭(zhēng)活性。以18 mg/kg的劑量成功建立了百草枯中毒模型，同時(shí)用百草枯模擬抗體解毒。中毒組顯微鏡觀察顯示,大鼠肺組織的損傷隨著實(shí)驗(yàn)天數(shù)的增加而日益加重,成批的炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肺纖維化逐日形成。而治療組肺組織炎癥減輕,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中未出現(xiàn)明顯纖維化。中毒組TGF-β1和IL-6水平隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，而治療組在注射百草枯模擬抗體后TGF-β1和IL-6水平呈下降趨勢(shì)。<