雙重組菌耦合不對(duì)稱還原生產(chǎn)（R）-或（S）-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的研究.pdf

1、手性化合物由于其特殊的生物活性，已經(jīng)在醫(yī)藥、農(nóng)藥、材料、香精香料及昆蟲信息素和激素等方面得到廣泛的應(yīng)用。近年來(lái)，用手性技術(shù)不對(duì)稱催化合成手性化合物及其手性中間體已經(jīng)引起了學(xué)術(shù)界和企業(yè)界的重視，成為研究開發(fā)的熱點(diǎn)。利用微生物酶不對(duì)稱催化具有反應(yīng)條件溫和、轉(zhuǎn)化率高及立體選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成了諸多手性合成方法的首選。本文將以4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)作為β-羰基酯還原的模型底物，利用基因工程技術(shù)構(gòu)建的重組大腸桿菌分別表達(dá)單一醛基還原酶和

2、羰基還原酶，研究用這兩個(gè)重組菌分別催化COBE不對(duì)稱還原為相應(yīng)R-或S-4-氯-3-羥基丁酸乙酯(CHBE)的反應(yīng)規(guī)律。為了解決輔酶再生的問題，構(gòu)建了表達(dá)葡萄糖脫氫酶的重組大腸桿菌作為還原型輔酶NADPH的再生系統(tǒng)，研究了分別與上述兩個(gè)重組菌耦合催化4-氯乙酰乙酸乙酯還原反應(yīng)的特性。 研究工作的主要進(jìn)展包括：一、從赭色擲孢酵母(SporobolomycessalmonicolorZJU010)細(xì)胞中克隆得到了醛基還原酶(NADP

3、H-dependentaldehydereductase，ALR)基因，構(gòu)建了含ALR基因的表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。通過篩選，獲得高效表達(dá)醛基還原酶的重組菌EcoliM15(pQE30-ALR)，經(jīng)培養(yǎng)和誘導(dǎo)條件優(yōu)化，該重組菌的比酶活提高到7.28U/mg，比酶活比原始菌株高14倍。在水相反應(yīng)體系中，選用COBE作為模型底物，重組菌EcoliM15(pQE30-ALR)能夠催化COBE不對(duì)稱還原為純手性的R-CHBE，e.e.值高達(dá)

4、100％，產(chǎn)率為98.5％；而利用赭色擲孢酵母催化的產(chǎn)物產(chǎn)率和e.e.值分別只有64.5％和63.5％。成功地解決了用酵母細(xì)胞催化COBE還原時(shí)產(chǎn)物e.e.較低的問題?？疾炝溯o酶及共底物、底物和產(chǎn)物濃度、pH值、溫度以及菌體密度等因素對(duì)反應(yīng)的影響。結(jié)果表明，由重組菌催化的不對(duì)稱還原必須在輔酶NADPH和輔酶再生酶系及輔底物葡萄糖的參與下才能進(jìn)行；底物和高濃度的產(chǎn)物對(duì)還原反應(yīng)有抑制作用；當(dāng)pH＞6.0時(shí)，反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率及產(chǎn)率都會(huì)顯著降低；高

5、密度重組細(xì)胞可以減少底物的抑制作用；通過分批加入底物的方式可以有效緩解水相體系底物的抑制，產(chǎn)物濃度可達(dá)90mmol/L。 二、為了解決重組菌M15(pQE30-ALR)催化還原反應(yīng)中還原型輔酶NADPH不足的問題，分別從巨大芽孢桿菌B.megateriumAS1.223和B.megateriumAS1.151中克隆到了兩個(gè)葡萄糖脫氫酶(glucosedehydrogenase，GDH)基因gdh151和gdh223，并構(gòu)建了重組

6、菌EcoliM15(pQE30-gdh223)和M15(pQE30-gdh151)。對(duì)這兩個(gè)重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前者的GDH比酶活是后者的11倍。對(duì)兩個(gè)葡萄糖脫氫酶氨基酸序列分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GDH223與GDH151僅有一個(gè)氨基酸差異，即GDH223的Arg39和GDH151的Ser39的差異。由于Arg39是葡萄糖脫氫酶催化NADP+還原活性中心必不可少的部分，正是因?yàn)檫@個(gè)差異造成重組菌M15(pQE30-gdh151)表達(dá)的G

7、DH151酶蛋白失活。對(duì)重組菌M15(pQE30-gdh223)培養(yǎng)和誘導(dǎo)條件進(jìn)行了優(yōu)化，比酶活可達(dá)4.45U/mg，單位體積發(fā)酵液酶活可達(dá)31U/mL。在此基礎(chǔ)上對(duì)重組菌M15(pQE30-gdh223)產(chǎn)生輔酶和催化輔酶再生的能力進(jìn)行了考察，證實(shí)重組菌表達(dá)的酶蛋白具有與商品酶同樣的輔酶再生能力。初步驗(yàn)證了重組菌M15(pQE30-gdh223)作為輔酶NADPH的再生系統(tǒng)，分別在與重組菌M15(pQE30-ALR)耦合催化COBE不

8、對(duì)稱還原反應(yīng)及與丙酮干細(xì)胞協(xié)同催化COBE還原反應(yīng)中起到提供輔酶和輔酶再生的作用。所構(gòu)建的輔酶NADPH再生系統(tǒng)簡(jiǎn)單而且有效，可以應(yīng)用于其它生物不對(duì)稱催化還原體系。 三、研究了由重組菌M15(pQE30-gdh223)與重組菌M15(pQE30-ALR)耦合系統(tǒng)催化COBE不對(duì)稱還原反應(yīng)的特點(diǎn)，考察了水相反應(yīng)體系中，底物濃度、雙菌的質(zhì)量比、葡萄糖濃度、溫度和轉(zhuǎn)速對(duì)雙菌反應(yīng)體系的影響。結(jié)果表明，底物濃度對(duì)雙菌轉(zhuǎn)化反應(yīng)有一定的抑制，

9、[COBE]＞60mmol/L，產(chǎn)物產(chǎn)率明顯降低；當(dāng)葡萄糖濃度為200mmol/L、溫度為34℃、搖床轉(zhuǎn)速100r/min，M15(pQE30-ALR)與M15(pQE30-gdh223)濕細(xì)胞質(zhì)量比為4：1的情況下，有最高的轉(zhuǎn)化效率。采用分批流加底物的操作方法，產(chǎn)物終濃度達(dá)到124mmol/L。初步研究了在鄰苯二甲酸二丁酯/磷酸鉀緩沖液兩相體系中，雙菌體系在當(dāng)初始底物濃度為360mmol/L時(shí)，產(chǎn)物總濃度為283mmol/L，產(chǎn)率達(dá)到

10、了78.6％。兩相體系可以有效地緩解底物和產(chǎn)物的抑制，但是對(duì)產(chǎn)物的e.e.值降低到了87％。 四、分別研究了有輔酶參與的重組菌表達(dá)醛基還原酶和葡萄糖脫氫酶催化雙底物反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)，結(jié)果表明，兩個(gè)反應(yīng)都可以用OrderedBiBi反應(yīng)機(jī)理描述，并從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)回歸得到了動(dòng)力學(xué)公式的常數(shù)，所得到的醛基還原酶(ALR)和葡萄糖脫氫酶(GDH)酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程可分別表示為： vALR=1.85[NADPH][COBE]/[NADP

11、H][COBE]+0.273[COBE]+0.21[NADPH]+0.218vGDH=22.327[NADP+][glu]/[NADP+][glu]+0.145[glu]+0.182[NADP+]+0.0473上述數(shù)學(xué)模型可以用于描述雙菌耦合體系催化COBE還原為(R)-CHBE的間歇過程。五、從木蘭假絲酵母(CandidamagnoliaZJU106)克隆得到了羰基還原酶(NADPH-dependentcarbonlyreducase

12、，CAR)的基因，并成功地在大腸桿菌中表達(dá)。在水相體系中，重組菌M15(pQE30-CAR)能催化COBE不對(duì)稱還原為單一手性純的(S)-CHBE，e.e.值約為100％。而用木蘭假絲酵母催化得到的產(chǎn)物e.e.值僅為57.5％。進(jìn)一步考察了重組菌M15(pQE30-CAR)和重組菌M15(pQE30-gdh223)耦合體系催化COBE不對(duì)稱還原反應(yīng)中的規(guī)律，結(jié)果表明，高濃度底物對(duì)反應(yīng)有抑制作用，但不如重組菌M15(pQE30-ALR)那