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1、具有光學(xué)活性的羥基化合物是手性藥物合成的重要中間體。利用微生物細(xì)胞或酶進(jìn)行生物催化制備手性化合物具有反應(yīng)條件溫和、轉(zhuǎn)化率高和立體選擇性高等優(yōu)點(diǎn),是一條有效的合成手性化合物途徑。
(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯(Ethyl S-4-chloro-3-hydorxybuytrate,S-CHBE)是合成甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑的關(guān)鍵手性砌塊。其經(jīng)濟(jì)有效的制備途徑是以4-氯乙酰乙酸乙酯(Ethyl4-chl
2、oroacetoacetate,COBE)為原料,由生物催化不對(duì)稱還原獲得。
本研究利用jcat軟件,對(duì)來(lái)源于Candida magnotiae(Genbank Ace.No.JC7338;GI∶11360538)的氨基酸序列進(jìn)行了E.coli密碼子偏嗜性優(yōu)化,人工設(shè)計(jì)并合成了酮還原酶(Ketoreductase,KRED)基因序列,成功地構(gòu)建了重組大腸桿菌BL21/pET28a-kred。對(duì)該重組菌進(jìn)行發(fā)酵和誘導(dǎo)條件優(yōu)化
3、,該重組菌表達(dá)酮還原酶比酶活達(dá)到了11.49 U/mg。利用重組菌E.coli BL21/pET28a-kred可以不對(duì)稱還原COBE生成S-CHBE。
由于利用重組菌E.coli BL21/pET28a-kred不對(duì)稱還原COBE制備S-CHBE的反應(yīng)需要輔酶NAD(P)H參與提供氫原子。為了避免過(guò)多的使用昂貴的輔酶,本研究從枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)中克隆出葡萄糖脫氫酶(glucose dehy
4、drogenase,GDH)基因,構(gòu)建重組菌E.coli BL21/pET28a-gdh,實(shí)現(xiàn)了葡萄糖脫氫酶高效表達(dá)。該重組菌利用葡萄糖作為底物可為反應(yīng)提供還原力。
對(duì)重組菌E.coli BL21/pET28a-kred與E.coli BL21/pET28a-gdh偶聯(lián)不對(duì)稱催化COBE的工藝進(jìn)行優(yōu)化,研究結(jié)果表明:在單水相中(磷酸鹽緩沖體系pH7.0)、25℃、葡萄糖50 g/L以及底物COBE24.2 g/L的條件下反
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