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文檔簡介
1、具有光學(xué)活性的羥基化合物是手性藥物合成的重要中間體。利用微生物細胞或酶進行生物催化制備手性化合物具有反應(yīng)條件溫和、轉(zhuǎn)化率高和立體選擇性高等優(yōu)點,是一條有效的合成手性化合物途徑。
(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯(Ethyl S-4-chloro-3-hydorxybuytrate,S-CHBE)是合成甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑的關(guān)鍵手性砌塊。其經(jīng)濟有效的制備途徑是以4-氯乙酰乙酸乙酯(Ethyl4-chl
2、oroacetoacetate,COBE)為原料,由生物催化不對稱還原獲得。
本研究利用jcat軟件,對來源于Candida magnotiae(Genbank Ace.No.JC7338;GI∶11360538)的氨基酸序列進行了E.coli密碼子偏嗜性優(yōu)化,人工設(shè)計并合成了酮還原酶(Ketoreductase,KRED)基因序列,成功地構(gòu)建了重組大腸桿菌BL21/pET28a-kred。對該重組菌進行發(fā)酵和誘導(dǎo)條件優(yōu)化
3、,該重組菌表達酮還原酶比酶活達到了11.49 U/mg。利用重組菌E.coli BL21/pET28a-kred可以不對稱還原COBE生成S-CHBE。
由于利用重組菌E.coli BL21/pET28a-kred不對稱還原COBE制備S-CHBE的反應(yīng)需要輔酶NAD(P)H參與提供氫原子。為了避免過多的使用昂貴的輔酶,本研究從枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)中克隆出葡萄糖脫氫酶(glucose dehy
4、drogenase,GDH)基因,構(gòu)建重組菌E.coli BL21/pET28a-gdh,實現(xiàn)了葡萄糖脫氫酶高效表達。該重組菌利用葡萄糖作為底物可為反應(yīng)提供還原力。
對重組菌E.coli BL21/pET28a-kred與E.coli BL21/pET28a-gdh偶聯(lián)不對稱催化COBE的工藝進行優(yōu)化,研究結(jié)果表明:在單水相中(磷酸鹽緩沖體系pH7.0)、25℃、葡萄糖50 g/L以及底物COBE24.2 g/L的條件下反
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