Frankia菌與榿木屬宿主植物共生關(guān)系的初步研究.pdf

1、分別在云南省來(lái)鳳山、高黎貢山、雞足山、蒼山和無(wú)量山，采集58個(gè)尼泊爾榿木(Alnus nepalensis)葉和根瘤樣品。在中國(guó)東北部的吉林長(zhǎng)白山，采集西伯利亞赤楊(A．sibirica)、色赤楊(A．tinctoria)和東北赤楊(A．mandshurica)葉和根瘤共21個(gè)樣品。用改進(jìn)的CTAB法提取植物葉片和根瘤中的植物和Frankia菌基因組DNA，對(duì)植物基因組DNA進(jìn)行RAPD-PCR反應(yīng)的體系和程序進(jìn)行了優(yōu)化。利用優(yōu)化的條件

2、，進(jìn)行樣品的RAPD-PCR分析。最后針對(duì)六個(gè)引物擴(kuò)增的穩(wěn)定結(jié)果進(jìn)行分析。用非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法(UPGMA)聚類分析，建立分子聚類樹(shù)狀圖，用POPGENE軟件分析Nei遺傳多樣性指數(shù)和Shannon遺傳多樣性指數(shù)。對(duì)Frankia菌基因組DNA用rep-PCR和nifD-nifK IGS PCR-RFLP方法分析其遺傳多樣性，建立聚類樹(shù)狀圖。結(jié)合植物和Frankia菌的遺傳多樣性，進(jìn)行Alnus-Frankia共生關(guān)系的初步探討。得到

3、的結(jié)果及推論如下： 適合于榿木屬的擴(kuò)增體系為：PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積為20μL，DNA模板約10ng，Mg<'2+> 4mmol·L<'-1>，dNTP0.2 mmol·L<'-1>，引物1μmol·L<'-1>，10×PCR buffer 2μL，TaqDNA聚合酶2.5U。適合于榿木屬的擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，33℃退火1min，72℃延伸1min30s，循環(huán)45次，最后在72℃終延伸10min。

4、 依據(jù)聚類分析的結(jié)果，分布在云南的尼泊爾榿木可在68％的相似性上分為6組(group)。其中基因型類群Ⅰ和Ⅳ幾乎在各地區(qū)均有分布，Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ分別為高黎貢山、來(lái)風(fēng)山、無(wú)量山、蒼山和雞足山特有的類群。同時(shí)，各山都有其占據(jù)優(yōu)勢(shì)的類群。在高黎貢山，蒼山，雞足山和無(wú)量山，它們的優(yōu)勢(shì)類群即為各自的特有類群。 通過(guò)計(jì)算，尼泊爾榿木各居群香農(nóng)遺傳多樣性指數(shù)分別為，來(lái)鳳山0.3247，高黎貢山0.3489，蒼山0.3220，雞足山10.

5、3929，無(wú)量山0.3472。宿主植物的遺傳多樣性分析的結(jié)果顯示，云南的尼泊爾榿木遺傳多樣性豐富，其中雞足山尼泊爾榿木居群多樣性指數(shù)最高，其次分別是高黎貢山、無(wú)量山、來(lái)鳳山、蒼山居群。無(wú)量山居群中，分布在南坡的尼泊爾榿木香農(nóng)多樣性指數(shù)為0.3254，分布在北坡的尼泊爾榿木香農(nóng)多樣性指數(shù)為0.3031，因此南坡的尼泊爾榿木居群遺傳多樣性高于分布于北坡的。在海拔1300-2400米的范圍內(nèi)，高黎貢山的尼泊爾榿木多樣性指數(shù)，隨著海拔的升高呈上

6、升趨勢(shì)的變化規(guī)律十分明顯。尼泊爾榿木的遺傳結(jié)構(gòu)與分布的環(huán)境區(qū)域有密切的關(guān)系，區(qū)域特點(diǎn)是決定尼泊爾榿木遺傳多樣性水平的重要因子之一。各不同基因型類群尼泊爾榿木的分布與海拔相關(guān)。遺傳變異的水平與自然環(huán)境脅迫成正相關(guān)。 對(duì)分布在中國(guó)西南部云南省高黎貢山的尼泊爾榿木，分布在中國(guó)東北部的吉林長(zhǎng)白山的色赤楊，西伯利亞赤楊和東北赤楊樣品的RAPD-PCR分析結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，分布在高黎貢山的尼泊爾榿木可能是比分布在長(zhǎng)白山的西伯利亞赤楊，色赤楊和東

7、北赤楊更古老的種，東北赤楊是最進(jìn)化的種，色赤楊和西伯利亞赤楊有較近的親緣關(guān)系。這一結(jié)果與陳之端等的研究結(jié)論一致。 選擇高黎貢山和長(zhǎng)白山的樣品作為起源中心和分化中心的代表，通過(guò)Frankia與其宿主植物的共生關(guān)系初步研究發(fā)現(xiàn)，宿主植物親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近與其對(duì)應(yīng)共生Frankia菌的關(guān)系遠(yuǎn)近基本一致，并且在宿主植物和Frankia菌中，各居群遺傳多樣性水平的高低表現(xiàn)一致，即宿主植物居群遺傳多樣性水平最高的，其對(duì)應(yīng)Frankia菌居群遺傳

8、多樣性水平也最高。本文中具體表現(xiàn)為高黎貢山的尼泊爾榿木及其根瘤內(nèi)Frankia菌種群的遺傳多樣性水平最高；東北的西伯利亞赤楊和色赤楊及其根瘤內(nèi)Frankia菌種群的多樣性水平居中；東北赤楊及其根瘤內(nèi)Frankia菌的遺傳多樣性水平最低。結(jié)合四種宿主植物不同的進(jìn)化地位，可以認(rèn)為Frankia居群遺傳多樣性水平與其宿主植物的進(jìn)化地位密切相關(guān)。 依據(jù)長(zhǎng)白山三種赤楊以及雞足山和無(wú)量山的尼泊爾榿木根瘤內(nèi)Frankia基因多樣性的rep-P

9、CR分析，對(duì)不同宿主植物與不同基因型類群Frankia菌的共生搭配關(guān)系、共生頻率及相關(guān)系數(shù)進(jìn)行探討，發(fā)現(xiàn)宿主植物和Frankia菌彼此間的選擇性體現(xiàn)在了基因水平上，這種選擇性與海拔等環(huán)境因素有一定的相關(guān)性。各不同基因型類群的Frankia菌有不同的共生能力，有的宿主范圍較廣，而有些則較窄。各自的共生體系中都有其優(yōu)勢(shì)的或特有的共生模式(即host group-Frankia group)。 對(duì)共生關(guān)系的初步分析推測(cè)，宿主植物和Fr