基于生物大分子材料的肝臟組織工程學(xué)研究.pdf

1、肝移植是目前發(fā)生肝功能衰竭病人的最好治療途徑，但是由于受到器官短缺的限制，且醫(yī)療費(fèi)用高昂，需要終身抑制免疫功能，因此肝移植難以受惠于更多肝病患者?；诟杉?xì)胞和生物材料在器官再生方面的迅速發(fā)展，尋找合適的生物材料編織成一種可支撐干細(xì)胞的支架是目前肝臟組織工程學(xué)需解決的科學(xué)問題。HCCs的合成基于膠原蛋白和殼聚糖的交聯(lián)作用，聯(lián)合HGF后進(jìn)一步分析材料學(xué)綜合特性。AFP，ALB和HNF4a基因表達(dá)量用于分析BMSCs的分化情況;Periodi

2、c-schiff染色用于評(píng)估糖原合成;CK18和ALB的免疫熒光檢測評(píng)估干細(xì)胞分化程度。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步開展了搭載HGF的HCCs聯(lián)合BMSCs動(dòng)物體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)。觀察了移植組織CK18免疫組化和CK19免疫熒光。檢測術(shù)后兩周移植組織ALB，CYP2C9及UGT2的含量。
　　第二部分實(shí)驗(yàn)中利用3D生物打印機(jī)編織了一種3D肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞-水凝膠支架進(jìn)行肝臟組織工程學(xué)研究。3D水凝膠在體外實(shí)驗(yàn)中被檢測到具有良好的生物相容性。在SD大鼠體內(nèi)開展

3、移植實(shí)驗(yàn)，對(duì)照組，水凝膠組，水凝膠+HL-7702細(xì)胞和水凝膠+HGF分別被植入行可致死量的3/4大部分肝臟切除后的大鼠肝臟內(nèi)。術(shù)后1天、5天、10天檢測不同組別大鼠血清ALT，ALB，AST及總膽紅素含量，進(jìn)行移植組織中CYP1A2，CYP2C9，a-GST和UGT-2含量進(jìn)行比較。2周后觀察移植組織形態(tài)。移植組織取材后行H.E.染色，免疫組化CK18和Ckit進(jìn)行觀察比較。比較各組大鼠生存曲線變化情況。
　　第三部分實(shí)驗(yàn)中利用

4、3D生物打印機(jī)編織了一種3D分化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞-水凝膠支架進(jìn)行肝臟組織工程學(xué)研究。利用3D生物打印技術(shù)在三維環(huán)境下規(guī)則種植和培養(yǎng)分化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，在水凝膠的幫助下在體外形成類似肝臟三維結(jié)構(gòu)形態(tài)，可持續(xù)發(fā)揮肝臟所特有的功能。qPCR用于檢測干細(xì)胞分化后ALB，HNF4a和AFP的表達(dá);Periodic-Schiff染色用于評(píng)價(jià)干細(xì)胞分化后糖原的合成;CK18免疫熒光染色觀察細(xì)胞分化程度。MTT評(píng)價(jià)水凝膠3D生物打印后的生物相容性。

5、在3天、7天和10天檢測打印組織的體外合成GST，ALB和CYP2C9水平。最后將3D打印組織進(jìn)行SD大鼠皮下移植進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。分別在2周和4周定量檢測移植組織中ALB，CYP2C9和GST的含量。分別在2周和4周檢測不同組別中的ALB、AFP和HNF4a的mRNA表達(dá)量。各組移植組織在2周和4周分別取材后行免疫組化CK18和Ckit進(jìn)行觀察比較。傅立葉紅外光譜，熱重分析，降解速率測定，力學(xué)分析和溶脹分析結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)所用的合成材料性能

6、良好。干細(xì)胞分化后AFP，ALB和HNF4a的mRNA表達(dá)量顯著增高，糖原合成顯著增多，CK18表達(dá)顯著增強(qiáng)。移植組織切片在偏振光顯微鏡下觀察到有新生組織，CK19免疫組化、CK18免疫熒光表達(dá)陽性。ALB，CYP2C9和UGT2的含量在搭載干細(xì)胞組中表達(dá)顯著增多。3D生物打印細(xì)胞-水凝膠支架并不影響細(xì)胞的活力。植入3D打印肝臟組織后，血清ALT，ALB，AST及總膽紅素，移植組織中CYP1A2，CYP2C9，a-GST和UGT-2的水

7、平發(fā)生顯著改善(p＜0.05)。移植組織的H.E.染色，免疫組化CK18和Ckit進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)3D打印組可形成形態(tài)規(guī)則，結(jié)構(gòu)清晰可見的肝臟微單元。各組大鼠的生存曲線比較發(fā)現(xiàn)3D打印組的中位生存期要好于其余各組且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05）。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化培養(yǎng)后ALB、HNF4a和AFP的mRNA表達(dá)量變化顯著改變，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05）。分化后CK18表達(dá)陽性，PSA染色陽性。三維打印與二維培養(yǎng)、混合培養(yǎng)的生物相容性比較無

8、統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3D打印后ALB、GST和CYP2C9的含量在植入3天，7天和10天明顯改善(p＜0.05)。經(jīng)3D打印后再生的肝臟微單元形態(tài)規(guī)則，結(jié)構(gòu)清晰可見。移植組織中ALB、AFP和HNF4A的mRNA表達(dá)量明顯改善。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果3D打印組的ALB、GST和CYP2C9的含量在2周及4周與對(duì)照組相比明顯改善(P＜0.05)。搭載肝細(xì)胞生長因子的膠原殼聚糖支架聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)移植后形態(tài)規(guī)則，結(jié)構(gòu)完整，可持續(xù)穩(wěn)定發(fā)揮肝臟特殊功能