鱖魚(yú)腫瘤壞死因子α基因的克隆和鑒定.pdf

1、水生生物學(xué)鱖魚(yú)(Siniperca chuatsi)是原產(chǎn)我國(guó)的淡水肉食魚(yú)類(lèi)，是我國(guó)重要的養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)品種，具有較大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。鱖魚(yú)傳染性脾腎壞死病毒(infectious spleenand kidney necrosis virus，ISKNV)是近年廣東鱖魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)爆發(fā)性流行病的主要病因之一，對(duì)鱖魚(yú)的養(yǎng)殖造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。之前的研究表明：ISKNV主要攻擊鱖魚(yú)脾和腎，引起脾腎細(xì)胞的腫大和壞死。 通過(guò)簡(jiǎn)并引物技術(shù)(degene

2、rate primer technique)從健康鱖魚(yú)的脾中獲得了腫瘤壞死因子a(tumor necrosis factor-a，F(xiàn)NF—a)的cDNA片段，接著通過(guò)快速擴(kuò)增cDNA末端(rapid amplification of cDNA ends，RACE)技術(shù)，克隆得到了TNF—a全長(zhǎng)cDNA序列，最后以基因組DNA為模板，擴(kuò)增、并測(cè)序得到了鱖魚(yú)TNF—a的基因結(jié)構(gòu)。鱖魚(yú)TNF—a的cDNA序列全長(zhǎng)為1461 bp(base p

3、air)，包含一個(gè)長(zhǎng)度為762 bp的開(kāi)放閱讀框(open reading flame，ORF)，編碼253個(gè)氨基酸(不包括終止子)。對(duì)鱖魚(yú)TNF—a氨基酸序列的生物信息學(xué)分析表明：與其他已報(bào)道的魚(yú)類(lèi)TNF—a和哺乳類(lèi)TNF—a相比，鱖魚(yú)TNF—a有著相似的半胱氨酸殘基位置，跨膜序列和蛋白酶切割序列。鱖魚(yú)TNF—a基因長(zhǎng)度為1940 bp，由四個(gè)外顯子和三個(gè)內(nèi)含子組成。通過(guò)對(duì)其基因上游序列(5’flanking region)的分析預(yù)測(cè)

4、發(fā)現(xiàn)了三個(gè)可能的NF-кB/rel調(diào)控位點(diǎn)。通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，顯示鱖魚(yú)TNF—a與日本鱸魚(yú)TNF—a等已報(bào)道的魚(yú)類(lèi)TNF—a基因聚類(lèi)在一起，而與已報(bào)道的哺乳動(dòng)物的TNF—a基因相距較遠(yuǎn)。通過(guò)同源模建技術(shù)預(yù)測(cè)了鱖魚(yú)TNF—a的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明鱖魚(yú)TNF—a蛋白的三維結(jié)構(gòu)從整體上類(lèi)似于已報(bào)道的人類(lèi)TNF—a蛋白的三維晶體結(jié)構(gòu)，但是在細(xì)節(jié)上稍顯簡(jiǎn)單。 應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，分析了鱖魚(yú)TNF-a在健康鱖魚(yú)中的組織器官分布和在

5、感染ISKNV不同時(shí)段各免疫器官及血中的時(shí)空表達(dá)情況。組織器官分布顯示：鱖魚(yú)TNF-a在所有被檢測(cè)的器官中都有表達(dá)。其中以脾，后腎，心等器官中的表達(dá)量最高，在腦中的表達(dá)量最低。在不同的時(shí)間對(duì)感染ISKNV的鱖魚(yú)的脾，頭。腎，后腎和血細(xì)胞的TNF-a表達(dá)譜分析表明：在感染的幾個(gè)臨床階段中，TNF-a在鱖魚(yú)的頭腎和后腎中并未出現(xiàn)表達(dá)量的明顯變化。而在脾臟和血細(xì)胞中，TNF-a在ISKNV感染后的第四天，即臨床中的無(wú)癥狀期出現(xiàn)了顯著的高表達(dá)。

6、這種高表達(dá)在感染后的第7天，第10天和第15天逐漸下降。 我們利用pET 32a(+)質(zhì)粒構(gòu)建了成熟態(tài)鱖魚(yú)TNF-a的重組質(zhì)粒。將該重組質(zhì)粒于BL21大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)并純化后發(fā)現(xiàn)，鱖魚(yú)成熟態(tài)TNF-a的重組蛋白的分子量約為18.5 kD，與預(yù)測(cè)結(jié)果非常接近。在TNF-a和放線菌酮(cycloheximide，CHX)聯(lián)合誘導(dǎo)人類(lèi)宮頸癌細(xì)胞HeLa凋亡的模型中發(fā)現(xiàn)：商品人類(lèi)重組TNF-a(20 ng/ml)和CHX(10μg/m