艾葉EA部位抗HBV活性成分分析.pdf

1、艾葉為菊科植物艾(Artemisia argyi Lévl.et Vant.)的干燥葉，在全國各地都有分布，資源豐富，是我國傳統(tǒng)中藥，以葉入藥。古書記載為“止血要藥”，有散寒止痛、溫經(jīng)止血的功效，也是婦科常用藥?，F(xiàn)代實(shí)驗(yàn)研究表明艾葉具有抗菌、抗病毒、平喘、利膽、抑制血小板聚集等多種藥理作用，臨床上也有多種中藥方劑或者西藥中含有艾葉或者艾葉有效成分，用于治療心血管系統(tǒng)，消化系統(tǒng)，胃腸道系統(tǒng)以及子宮等多種系統(tǒng)疾病。研究發(fā)現(xiàn)艾葉的主要化學(xué)成分

2、包括揮發(fā)油、香豆素類、黃酮類、甾醇類、萜類、微量元素等。
　　本課題組前期通過體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)，首次發(fā)現(xiàn)艾葉揮發(fā)油和乙酸乙酯提取物具有抗乙肝病毒活性，并研究有效部位及其在制備抗乙肝病毒藥物中的應(yīng)用，獲國家發(fā)明專利授權(quán)2項(xiàng)。為進(jìn)一步探索乙酸乙酯提取物（EA）中抗HBV有效部位，明確藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，本課題在前期研究基礎(chǔ)上，對(duì)EA的化學(xué)成分進(jìn)一步分析，并研究所得單體化合物抗HBV活性。
　　1. EA不同極性部位制備。取艾葉適量，粉碎

3、，先用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，收集油后過濾，藥渣曬干后再依次以石油醚（30~60℃）、乙酸乙酯回流提取，分別提取兩次，得到乙酸乙酯浸膏(EA)，共投料約10kg，得到EA206.873g。將EA再依次以石油醚（60~90℃）、石油醚-乙酸乙酯（1:1）、60％乙醇回流提取，各提取兩次，分別得到提取物EA-1（96.821g）、EA-2(66.121g)和EA-3(12.520g)，60%乙醇提取后所得濾渣為EA-4(5.911g)。

4、r>　　2. EA-1、EA-2、EA-3和EA-4的分離純化。通過硅膠柱層析、重結(jié)晶、制備薄層色譜等方法分別對(duì)四部位化學(xué)成分進(jìn)行分離純化，共得到12個(gè)單體化合物。系統(tǒng)預(yù)實(shí)驗(yàn)初步分析：化合物1、2、3、5為甾體、三萜類，化合物4、6、7、8、9、10為黃酮類，化合物11、12為香豆素類。
　　3．化合物1-12的結(jié)構(gòu)鑒定。用薄層色譜自身高、低濃度對(duì)照法，三種溶劑系統(tǒng)展開，不同顯色條件鑒定，各化合物純度：化合物1-12純度均大于99

5、%；通過TLC、1H-NMR、13C-NMR及MS等手段進(jìn)行分析鑒定：化合物1和化合物5相同，為正三十一烷；化合物2和化合物3相同，為豆甾醇；化合物4、7、8和10相同，為5,4'-二羥基-6,7,3'-三甲氧基黃酮；化合物9為5,7,4'－三羥基－3',8－二甲氧基黃酮；化合物11和化合物12是將處理后的Ⅰ-F段、Ⅱ-E、處理后的Ⅱ-G段和Ⅲ-C段合并后通過制備薄層的方法得到的，化合物11為傘形花內(nèi)酯即7-羥基香豆素；化合物12為東莨

6、菪內(nèi)酯即7-羥基-6-甲氧基香豆素?；衔?由于缺少相關(guān)二維圖譜，一些峰無法進(jìn)行歸屬，因此無法確定其結(jié)構(gòu)。
　　4.各化合物體外抗HBV活性實(shí)驗(yàn)。采用HepG2.2.15細(xì)胞模型，待測(cè)樣品共七個(gè)，分別為化合物2（豆甾醇）、化合物4（5,4'-二羥基-6,7,3'-三甲氧基黃酮）、化合物6，化合物9（5,7,4'－三羥基－3',8－二甲氧基黃酮）、化合物11（7-羥基香豆素）、化合物12（7-羥基-6-甲氧基香豆素）和化合物FAA2

7、0120831A（達(dá)瑪二烯醇乙酸酯）。采用MTT法測(cè)定各化合物對(duì) HepG2.2.15細(xì)胞的毒性作用，采用ELISA法測(cè)定各化合物對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞上清液中HBsAg和HBeAg分泌的影響，結(jié)果表明：各化合物對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞均有一定的毒性，其中化合物2的半數(shù)毒性濃度（TC50）為117.7μg·mL-1，化合物4的TC50值為51.3μg·mL-1，化合物6的TC50值為33.0μg·mL-1，化合物9的TC50值為1

8、4.8μg·mL-1，化合物11的TC50值為30.4μg·mL-1，化合物12的TC50值為65.0μg·mL-1，化合物 FAA20120831A的TC50值為115.3μg·mL-1；各化合物對(duì)HBsAg和HBeAg均有抑制作用，且呈劑量時(shí)間依賴性，其中化合物4對(duì)HBeAg的半數(shù)抑制濃度（IC50）為11.5μg·mL-1，化合物11對(duì)HBsAg的半數(shù)抑制濃度（IC50）為14.5μg·mL-1；給藥第九天后化合物4對(duì)HBeAg的