資木瓜活性成分分析及其抗小鼠CIA的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：研究資木瓜中所含的幾類(lèi)活性成分及其含量，建立細(xì)胞模型篩選具有抑制肥大細(xì)胞脫顆粒作用的活性成分，建立CIA小鼠模型研究篩選出的資木瓜活性成分對(duì)該動(dòng)物模型的作用及機(jī)制。
　　方法：（1）紫外分光光度法檢測(cè)資木瓜中總皂苷和總黃酮的含量；（2）高效液相色譜法檢測(cè)資木瓜中齊墩果酸和熊果酸的含量；（3）通過(guò)系統(tǒng)溶劑法、D101大孔吸附樹(shù)脂、正反相硅膠、制備液相等分離法，結(jié)合LC-MS，NMR等現(xiàn)代儀器分析方法分離鑒定資木瓜所含單體成分；

2、（4）通過(guò)RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒實(shí)驗(yàn)篩選具有抑制肥大細(xì)胞脫顆粒活性的成分段；（5）取10周齡DBA/1小鼠28只，隨機(jī)均分為4組（n=7）：正常組、模型組、低劑量組和高劑量組。使用牛二型膠原和弗氏完全佐劑建立小鼠CIA模型，連續(xù)給藥3周，頸椎脫臼處死小鼠。取小鼠血清、四肢、脾臟，ELISA法檢測(cè)血清中TNF-α、IL-2、IL-4含量，四肢脫鈣包埋切片后進(jìn)行HE染色。脾臟稱(chēng)重后計(jì)算脾指數(shù)。（6）免疫組化法檢測(cè)各組小鼠四肢滑膜組織中肥大

3、細(xì)胞類(lèi)胰蛋白酶和Treg細(xì)胞FOXP3的表達(dá)變化。（7）TUNEL法檢測(cè)各組小鼠四肢滑膜組織中滑膜細(xì)胞凋亡變化。
　　結(jié)果：（1）資木瓜產(chǎn)區(qū)五個(gè)縣市所產(chǎn)木瓜中總皂苷和總黃酮的含量分別在35.41-58.29 mg/g、4.09-4.69 mg/g之間。齊墩果酸含量在0.60％-0.90%之間，熊果酸含量在0.17%-0.45%之間，齊墩果酸加熊果酸總含量在0.91%-1.07%之間。（2）從資木瓜NBF-50%中分離出單體成分莽草

4、酸丁酯。（3）RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒實(shí)驗(yàn)顯示NBF-50%對(duì)脫顆粒的抑制作用較好。（4）與空白組相比，模型組小鼠四肢的關(guān)節(jié)炎評(píng)分和足腫脹度均明顯升高，低劑量組和高劑量組小鼠的關(guān)節(jié)炎評(píng)分和足腫脹度也有所升高，但相比于模型組，程度減輕，且高劑量組減輕更明顯。HE染色結(jié)果顯示模型組小鼠關(guān)節(jié)病理破壞嚴(yán)重、滑膜有向關(guān)節(jié)腔內(nèi)增生趨勢(shì)，而低、高劑量組小鼠呈濃度依賴(lài)性的改善。（5）類(lèi)胰蛋白酶檢測(cè)結(jié)果顯示，相對(duì)于空白組，模型組小鼠滑膜組織中類(lèi)胰蛋白酶陽(yáng)

5、性表達(dá)的肥大細(xì)胞數(shù)量顯著增多，低、高劑量組小鼠類(lèi)胰蛋白酶陽(yáng)性表達(dá)的肥大細(xì)胞數(shù)量相比模型組回落,且呈劑量依賴(lài)性。（6）免疫組化檢測(cè)FOXP3表達(dá)發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠滑膜組織中幾乎無(wú)FOXP3表達(dá)，而低劑量組中出現(xiàn)FOXP3陽(yáng)性表達(dá)，高劑量組中FOXP3陽(yáng)性表達(dá)增加。（7）血清ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，相比于正常組，模型組小鼠血清TNF-α和IL-2水平顯著升高，低劑量組有所降低、高劑量組顯著降低，而模型組小鼠血清IL-4水平相比正常組降低，給藥組呈

6、劑量依賴(lài)性升高。（8）TUNEL檢測(cè)小鼠四肢滑膜組織滑膜細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組滑膜細(xì)胞凋亡無(wú)明顯變化，而低高劑量組滑膜細(xì)胞凋亡增加，且高劑量組滑膜細(xì)胞凋亡增加更為明顯。
　　結(jié)論：長(zhǎng)陽(yáng)木瓜中總皂苷和總黃酮的含量分別為46.49 mg/g、4.09 mg/g，五個(gè)樣本中長(zhǎng)陽(yáng)木瓜齊墩果酸含量最高，為0.90%，齊墩果酸加熊果酸總含量也最高，為1.07%。在系統(tǒng)分離資木瓜所得成分段中，NBF-50%對(duì)RBL-2H3細(xì)胞脫