納米碳黑與重金屬聯(lián)合染毒對BEAS-2B細胞的聯(lián)合毒性作用模式與機制研究.pdf

1、目的:空氣顆粒物（Particulate Matter, PM）是危害我國居民健康的主要環(huán)境因素之一，其健康效應(yīng)及潛在毒性機制越來越受到人們關(guān)注。研究表明，不同地區(qū)、不同季節(jié)的PM組分差異較大，往往造成毒理學(xué)研究結(jié)果的可比性較低，難以充分了解PM的毒性效應(yīng)及潛在機制。目前，對于PM毒性效應(yīng)研究多是針對PM整體或針對其單一組分（如金屬或有機成分等），很少考慮主要組分間的聯(lián)合毒性作用。而選擇PM中代表性組分進行聯(lián)合毒性的研究，對于闡明PM的

2、毒性作用特征、比較不同顆粒物的毒性差異和開展PM健康危害評估具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。因此，本研究通過對PM中代表性組分納米碳黑(NPCB)和重金屬(Pb/Cr/Cd)對BEAS-2B細胞的聯(lián)合毒性效應(yīng)研究，旨在闡明PM主成分的聯(lián)合毒性作用模式，為PM的風(fēng)險評估提供實驗依據(jù)。
　　方法:本課題第一部分主要探討了NPCB和重金屬(Pb/Cr/Cd)對BEAS-2B細胞的聯(lián)合毒性作用模式，主要指標包括基本細胞毒性、氧化損傷、周期和

3、凋亡。采用細胞毒性檢測試劑盒(CCK-8)和乳酸脫氫酶試劑盒（LDH Cytotoxicity Assay Kit）檢測納米碳黑(NPCB)和重金屬(Pb/Cr/Cd)聯(lián)合染毒24h對BEAS-2B細胞存活率和LDH漏出率的影響;采用DCFH-DA探針對NPCB和重金屬(Pb/Cr/Cd)聯(lián)合染毒3h后BEAS-2B的ROS水平進行檢測，采用總抗氧化能力試劑盒和SOD活性檢測試劑盒檢測NPCB和重金屬(Pb/Cr/Cd)聯(lián)合染毒24h后

4、的細胞抗氧化能力，采用單細胞凝膠電泳技術(shù)檢測聯(lián)合染毒24h的細胞DNA損傷程度，采用流式細胞術(shù)（PI染色）檢測聯(lián)合染毒24h的細胞周期改變，采用AnnexinⅤ/PI細胞凋亡檢測試劑盒檢測NPCB和重金屬(Pb/Cr/Cd)聯(lián)合染毒24h的細胞凋亡率。本課題第二部分對DNA損傷修復(fù)通路在NPCB與重金屬聯(lián)合染毒致DNA損傷中的作用機制進行了初步研究。采用Western Blot檢測NPCB與三種重金屬聯(lián)合染毒對細胞DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白

5、ATM、p-p53/p53和γH2AX表達的影響。
　　結(jié)果與討論:基本細胞毒性的研究結(jié)果顯示，NPCB與重金屬(Pb/Cr/Cd)聯(lián)合染毒在細胞存活率和LDH漏出方面存在聯(lián)合作用，但聯(lián)合作用模式隨金屬不同、劑量不同以及評價指標不同而不同。低劑量Pb與NPCB聯(lián)合作用對細胞存活率無交互作用，對細胞LDH漏出率表現(xiàn)為拮抗作用，高劑量Pb與NPCB聯(lián)合染毒對細胞存活率表現(xiàn)為協(xié)同作用，對細胞LDH漏出率則無明顯交互作用;Cd、Cr與NP

6、CB聯(lián)合染毒在細胞存活率方面均表現(xiàn)為協(xié)同作用，低劑量Cd和Cr與NPCB對細胞LDH漏出率不存在聯(lián)合作用，高劑量時均表現(xiàn)為協(xié)同作用。
　　ROS檢測結(jié)果顯示聯(lián)合染毒明顯促進了ROS的生成;細胞總抗氧化能力和SOD活性檢測結(jié)果顯示，NPCB與三種重金屬聯(lián)合染毒在細胞總抗氧化能力和SOD活性方面存在聯(lián)合作用，Pb和Cr與NPCB聯(lián)合作用對總抗氧化能力表現(xiàn)為協(xié)同作用，Cd與NPCB聯(lián)合作用在總抗氧化能力上無明顯聯(lián)合作用;Cd和Cr與NP

7、CB聯(lián)合作用對SOD表現(xiàn)為協(xié)同作用，Pb與NPCB聯(lián)合作用在SOD上無明顯聯(lián)合作用;單細胞凝膠電泳結(jié)果顯示，三種重金屬與NPCB聯(lián)合染毒均明顯增強了細胞DNA損傷程度，方差分析結(jié)果顯示聯(lián)合作用模式為協(xié)同作用;在細胞周期阻滯和細胞凋亡方面，三種重金屬與NPCB均無明顯聯(lián)合作用。
　　Western Blot檢測結(jié)果顯示，與對照組和金屬單獨作用組相比，三種重金屬與NPCB聯(lián)合作用對這三種蛋白的表達均產(chǎn)生了不同程度的影響，提不ATM-p

8、53-H2AX這條DNA損傷修復(fù)通路很可能在NPCB與重金屬的聯(lián)合染毒中發(fā)揮重要作用，然而其具體機制還需研究證實。
　　結(jié)論:NPCB與重金屬對BEAS-2B細胞存在聯(lián)合毒性作用，可以通過誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生大量ROS、降低細胞抗氧化防御能力引起細胞氧化損傷，尤其是DNA氧化損傷。聯(lián)合作用模式分析結(jié)果顯示，不同金屬與NPCB的聯(lián)合作用模式隨金屬不同、劑量不同以及評價指標不同而不同。此外，DNA損傷修復(fù)通路可能在聯(lián)合染毒引起的細胞DNA損傷