煙草煙霧凝集物所致BEAS-2B細(xì)胞及其線粒體損傷的機(jī)制.pdf

1、目的：
　　大量研究表明煙草煙霧能引起機(jī)體各個(gè)系統(tǒng)的疾病，而機(jī)體的疾病狀態(tài)往往與細(xì)胞線粒體的損傷有關(guān)。線粒體在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著至關(guān)重要的作用，在細(xì)胞凋亡的過程中，線粒體的膜通透性的異常，能引起線粒體膜電位的降低，相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)水平改變，細(xì)胞的氧化和抗氧化水平的失衡。研究線粒體在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中的具體機(jī)制，對(duì)于進(jìn)一步研究細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制具有重要意義。
　　本文旨在探索煙草煙霧凝集物(cigarette smoke

2、 condensate,CSC)對(duì)永生化人支氣管上皮細(xì)胞(immortalized human bronchial epithelial,BEAS-2B)的線粒體損傷機(jī)制，為進(jìn)一步研究CSC的毒作用機(jī)制以及預(yù)防煙草煙霧引發(fā)機(jī)體疾病提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　　1.用CSC對(duì)融合至70％左右的BEAS-2B細(xì)胞進(jìn)行染毒，染毒持續(xù)24小時(shí)，染毒后的BEAS-2B細(xì)胞即為實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞。
　　2.設(shè)立二甲基亞砜組（Dimet

3、hyl Sulfoxide，DMSO）為溶劑對(duì)照組、正常未染毒BEAS-2B組（空白對(duì)照組）、CSC染毒組，通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、劃痕實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀、ELISA、CCK-8技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞形態(tài)變化、細(xì)胞凋亡率以及功能改變。
　　3.運(yùn)用ELISA、Western blot、RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的線粒體膜電位是否改變以及各組細(xì)胞凋亡相關(guān)基因、蛋白的相對(duì)表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.CSC染毒對(duì)BEAS-2B細(xì)胞形

4、態(tài)及功能的影響
　　CSC染毒后抑制了 BEAS-2B細(xì)胞活性，且隨CSC染毒終濃度的增加，BEAS-2B細(xì)胞存活率不斷下降，呈現(xiàn)出劑量效應(yīng)關(guān)系；
　　與空白對(duì)照組BEAS-2B細(xì)胞相比，DMSO溶劑對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)上沒有明顯變化；0.02mg/mLCSC染毒組細(xì)胞及胞核的形態(tài)均無明顯改變，但少數(shù)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡，0.04mg/mL組細(xì)胞出現(xiàn)腫脹變形，細(xì)胞核開始增大變形，核仁增大，出現(xiàn)核畸形；0.06mg/mL組開始胞膜形態(tài)開始

5、變形，胞膜間出現(xiàn)了針刺樣突起，胞內(nèi)出現(xiàn)大量空泡；0.08mg/mL組細(xì)胞面積增大，細(xì)胞及胞核明顯變形，一些細(xì)胞膜出現(xiàn)輪廓變形模糊，胞膜結(jié)構(gòu)開始崩解，少量細(xì)胞出現(xiàn)核碎裂等特征；
　　在6h、12h、24h、48h檢測(cè)點(diǎn)時(shí)，溶劑對(duì)照組及各CSC濃度組細(xì)胞的遷移距離差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。DMSO組與正常BEAS-2B細(xì)胞組遷移距離的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P?0.05)。
　　2.染毒后各組細(xì)胞ROS的檢測(cè)
　

6、　激光共聚焦顯微鏡下觀察到隨著CSC染毒濃度的提高，細(xì)胞內(nèi)ROS熒光信號(hào)強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)。熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果顯示 DMSO組與各CSC染毒組整體ROS水平具有差異，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=143.390，P﹤0.05）；DMSO組與0組（空白對(duì)照）組間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P?0.05）；各不同濃度CSC染毒組細(xì)胞間ROS水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P﹤0.05）。
　　3.SOD活性檢測(cè)
　　以DMSO組為對(duì)照，各組細(xì)胞整體SO

7、D活力水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=195.680，P﹤0.05），除空白對(duì)照組外，各CSC染毒組細(xì)胞與DMSO組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。隨著CSC染毒濃度的提高，SOD活力單位逐漸降低。
　　4.細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)
　　以DMSO組為對(duì)照，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示：DMSO溶劑對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P?0.05)。不同濃度CSC處理后，細(xì)胞的凋亡率上升。CSC染毒組細(xì)

8、胞凋亡率均大于DMSO組細(xì)胞(均P<0.05)，且隨著CSC染毒濃度的升高，細(xì)胞凋亡率逐漸升高。
　　5.線粒體膜電位的檢測(cè)
　　激光共聚焦顯微鏡下觀察到隨著CSC染毒濃度的提高，細(xì)胞內(nèi)紅綠熒光比明顯下降，提示CSC染毒BEAS-2B細(xì)胞引起其線粒體膜電位下降，且膜電位下降程度隨CSC染毒濃度的升高而增強(qiáng)。
　　6.各組細(xì)胞Bcl-2、Bax、Cyt-C和caspase-3基因mRNA的檢測(cè)
　　熒光定量qPCR

9、檢測(cè)結(jié)果顯示0組（空白對(duì)照組）細(xì)胞與DMSO組間mRNA的表達(dá)量相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P?0.05），而其余各CSC濃度染毒組Bcl-2、Bax、Cyt-C和caspase-3基因mRNA表達(dá)量與DMSO組表達(dá)量間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；
　　Bcl-2基因：0.02組、0.04組、0.06組、0.08組的表達(dá)量均低于DMSO組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且隨CSC染毒濃度的提高，Bcl-2表達(dá)量逐漸降低；B

10、ax、Cyt-C和caspase-3基因：各CSC組表達(dá)量均高于DMSO組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），隨著CSC染毒濃度的提高，Bax、Cyt-C和caspase-3基因表達(dá)量逐漸升高。
　　7.Bcl-2、Bax和活化的caspase-3蛋白表達(dá)情況的檢測(cè)
　　Western Blot檢測(cè)細(xì)胞蛋白結(jié)果顯示：空白對(duì)照組與DMSO組的Bcl-2蛋白表達(dá)量相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P?0.05），而CSC染毒組的Bcl-2

11、蛋白表達(dá)量低于DMSO組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），空白對(duì)照組的Bax和活化的caspase-3蛋白的表達(dá)量與溶劑對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P?0.05）；CSC組Bax和活化的caspase-3蛋白表達(dá)量均高于DMSO組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　CSC誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷，導(dǎo)致細(xì)胞活力降低、細(xì)胞形態(tài)改變以及遷移能力改變，引起細(xì)胞內(nèi)氧化與抗氧化水平的失衡，線粒體在氧化