基于瓊脂糖液滴微流控的高通量單拷貝RNA放大方法及其在單細胞水平基因表達研究中的應用.pdf

1、液滴微流控技術(shù),具有體積小,樣品消耗少,分析速度快,靈敏度高等優(yōu)勢,已成為化學分析領(lǐng)域中一種重要的單分子分析方法,本文發(fā)展了一種瓊糖液滴微流控技術(shù),用于對單分子RNA/細胞進行液滴內(nèi)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR),并通過流式細胞儀分析檢測,實現(xiàn)了對單分子/細胞的高通量分析檢測。
　　 本文以低凝膠點瓊脂糖溶液為水相,以疏水改性后的雙水相通道玻璃微流控芯片為液滴生成器,制備單分散的油包瓊脂糖液滴,同時將RT-PCR所需反應物

2、和經(jīng)逐級稀釋的模板RNA/細胞包裹進瓊脂糖液滴內(nèi)進行單分子RT-PCR擴增。通過將引物偶聯(lián)到線性聚丙烯酰胺分子上,克服了傳統(tǒng)油包水液滴內(nèi)PCR由于磁性微球的引入帶來的擴增效率低以及有效液滴產(chǎn)生效率低的缺陷,同時可將擴增后的產(chǎn)物“囚禁”在瓊脂糖液滴內(nèi)。經(jīng)過去油、熒光染料染色后,含有模板分子/細胞的微球在激光下發(fā)出熒光,用顯微鏡成像、流式細胞等分析手段進行后續(xù)表征,實現(xiàn)了單分子/細胞的高通量高效率分析。同時,本文還對在新型油包水凝膠體系進行

3、單分子聚合酶鏈式反應(PCR)進行了探索。
　　 具體研究內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　 第二章中,制作了雙水相通道流聚焦型玻璃微流控芯片,經(jīng)疏水處理后,以2％的低熔點瓊脂糖溶液為水相,混合硅油為油相在芯片中形成了大小均一可調(diào)的油包瓊脂糖液滴,兩水相瓊脂糖可在生成的液滴中快速混勻。2％的瓊脂糖液滴經(jīng)過30輪的熱循環(huán)仍能夠保持良好的單分散性,說明瓊脂糖液滴具有良好的熱穩(wěn)定性。4℃冷卻充分凝膠后,通過多種有機試劑依次除去瓊脂糖周圍的

4、油相,最終得到能在水中長期穩(wěn)定保存的瓊脂糖凝膠微球,具有穩(wěn)定的機械性能,適用于后續(xù)的顯微鏡觀察和流式分析。
　　 第三章中,建立了油包瓊脂糖單分子RNA液滴RT-PCR技術(shù),熒光染料對瓊脂糖微球染色之后,通過熒光顯微鏡或流式分析實現(xiàn)了單分子RNA的高通量分析。基于本課題組之前發(fā)展的瓊脂糖液滴微流控PCR技術(shù),本章提出了用于高通量單分子RNA分析檢測的油包瓊脂糖液滴微流控技術(shù)。采用線性聚丙烯酰胺代替瓊脂糖大分子作為引物偶聯(lián)載體,不

5、僅有效避免了由于磁性微球的引入導致擴增效率低和有效液滴數(shù)產(chǎn)生效率低的缺陷,且相對于引物通過希夫堿反應共價偶聯(lián)到瓊脂糖分子上的偶聯(lián)方式,共價聚合偶聯(lián)到線性聚丙烯酰胺的方法更快速簡單,偶聯(lián)產(chǎn)率更高,偶聯(lián)后不會影響擴增反應。擴增后去油并熒光染料染色后通過熒光顯微成像或流式分析實現(xiàn)了對單分子RNA的高通量分析檢測。用熒光定量PCR對瓊脂糖液滴內(nèi)RT-PCR擴增效率進行表征,實驗結(jié)果表明在這種油包瓊脂糖液滴內(nèi)有很高的擴增效率,1.5拷貝/液滴的瓊

6、脂糖液滴經(jīng)過29輪的擴增反應每一輪的擴增效率可達80.1％。
　　 第四章中,開發(fā)了一種單細胞基因表達水平分析技術(shù)。基于第三章瓊中脂糖液滴內(nèi)單分子RNA的分析技術(shù),本文對單細胞基因表達水平進行了分析研究。EpCAM蛋白(epithelial cell adhesion molecule)在多數(shù)癌變細胞中是一種高表達蛋白,且已經(jīng)被科學家們公認為癌細胞腫瘤標記物。本文以EpCAM表達量不同的兩種細胞做為研究對象,通過微流控芯片將RT

7、-PCR所需反應物、細胞和細胞裂解液包裹于同一個液滴內(nèi),細胞裂解后進行RT-PCR擴增,擴增后去油、熒光染料染色并用流式細胞儀對其分析,首次實現(xiàn)了液滴內(nèi)的單細胞水平的高通量分析檢測。該技術(shù)在后續(xù)的細胞基因表達分析,癌癥等疾病的早期診斷方面具有良好的應用前景。
　　 第五章中,進行了新型油包水凝膠體系中單分子擴增技術(shù)可行性探索。海藻酸鈉、羧甲基纖維素鈉和聚丙烯酰胺等具有良好的生物兼容性,且其粘度比較低,易于在室溫下產(chǎn)生單分散好的液

8、滴,液滴易于固化凝膠。本文對海藻酸鈉、羧甲基纖維素鈉和聚丙烯酰胺三種水凝膠體系單分子擴增進行了探索,發(fā)現(xiàn):1)海藻酸鈉體系不能用于DNA的擴增;2)羧甲基纖維素鈉對PCR擴增沒有影響,且易于在微流控芯片上產(chǎn)生單分散液滴,液滴易于成膠,但是成膠過程中液滴嚴重縮水,包裹的物質(zhì)會泄露,解決辦法之一是將PCR擴增反應物偶聯(lián)到大分子上;3)聚丙烯酰胺凝膠能進行PCR擴增,油包丙烯酰胺液滴也可成膠。新型油包水凝膠體系由于其在微反應之后可固化成膠,大