用于單細(xì)胞分析的微流控芯片研究及其在腫瘤干細(xì)胞分離鑒定方面的應(yīng)用.pdf

1、細(xì)胞是生命活動的基本單位，傳統(tǒng)的細(xì)胞學(xué)研究依賴于大量細(xì)胞(103-104個)，把群體值作為測量結(jié)果。然而研究發(fā)現(xiàn)，即使是生活在同一環(huán)境、同一組織中的同種細(xì)胞，其在基因表達(dá)水平上也存在著很大差異。細(xì)胞之間存在異質(zhì)性，而群體分析會掩蓋細(xì)胞個體間的差異，因此，開發(fā)一種能有效分析單細(xì)胞組分的技術(shù)勢在必行。微流控芯片技術(shù)可以實現(xiàn)細(xì)胞進(jìn)樣、單細(xì)胞捕獲、細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞分選、細(xì)胞裂解以及分析檢測多個步驟整合在一起，并且具有高通量、小型化、平行化、自動化

2、、便攜化等優(yōu)勢，為單細(xì)胞研究提供了一個可行的技術(shù)平臺。
　　本論文研制了具有自主知識產(chǎn)權(quán)的單細(xì)胞分析微流控芯片，微流控芯片的主體采用了聚二甲基硅氧烷(poly(dimethylsiloxane)，PDMS)高聚物材料，利用PDMS高聚物具有良好氣體溶解性的特點(diǎn)實現(xiàn)負(fù)壓自吸式自動進(jìn)樣，使所研制的芯片像臨床的真空采血管一樣方便使用，不需輔助設(shè)備控制流路。將數(shù)千個細(xì)胞單獨(dú)分隔到不同的微反應(yīng)室，不再互相干擾，也不易發(fā)生漏檢，實現(xiàn)高通量單細(xì)

3、胞快速分離;隨即將分離開的單細(xì)胞直接進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)，節(jié)省了時間。每個反應(yīng)室容積5-10 nL，上千反應(yīng)室的一塊芯片也僅需試劑數(shù)微升，節(jié)省試劑。
　　本研究取得了以下創(chuàng)新性結(jié)果:(1)成功研制了集單細(xì)胞捕獲、裂解、RT-PCR反應(yīng)于一體的微流控芯片，并能用于單細(xì)胞數(shù)字PCR研究，通過研究不同單個A549腫瘤干細(xì)胞中CD133和管家基因GAPDH的基因表達(dá)驗證了細(xì)胞之間存在異質(zhì)性。(2)基于所研制的單細(xì)胞微流控芯片實

4、現(xiàn)了一步法快速鑒定腫瘤干細(xì)胞，利用腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD133對肺癌A549細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行鑒定。本文中所研制的微流控芯片易于操作、敏感度高（單細(xì)胞）、準(zhǔn)確性好（可計數(shù)）、省試劑（數(shù)微升/芯片），適合于普通實驗室進(jìn)行腫瘤干細(xì)胞等稀少細(xì)胞的快速鑒定。為腫瘤干細(xì)胞的研究提供了一種單細(xì)胞分離與特異性鑒定的新工具，可用于鑒定腫瘤干細(xì)胞的分子遺傳特征和特異標(biāo)志物，解決腫瘤干細(xì)胞特異性鑒定困難的問題。為腫瘤學(xué)研究提供科學(xué)依據(jù)，為臨床病情判斷、