花生種子休眠解除過(guò)程中相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究.pdf

1、花生是我國(guó)重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物，單產(chǎn)、面積、出口均居世界前列。近年來(lái)我國(guó)花生在收獲時(shí)期多逢陰雨天氣，花生在植株上發(fā)芽現(xiàn)象嚴(yán)重，嚴(yán)重影響花生的產(chǎn)量、品質(zhì)和種用質(zhì)量，其主要根源是目前選育推廣的花生新品種休眠性較弱。種子休眠性愈來(lái)愈成為花生重要的農(nóng)藝性狀，本研究篩選到強(qiáng)休眠的花生品種，并探討了影響花生休眠性的主要因素，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法挖掘花生種子休眠解除過(guò)程以及萌發(fā)相關(guān)的候選基因，以闡明花生種子休眠向萌發(fā)轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制，研究結(jié)果為后續(xù)開(kāi)展

2、休眠功能基因研究、分子育種實(shí)踐、培育適度休眠性的花生品種提供有價(jià)值信息。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　1.不同花生品種（系）種子休眠性有差異，干種子發(fā)芽率變幅為0％～100％;強(qiáng)休眠品種花育52號(hào)鮮種子發(fā)芽率和干種子發(fā)芽率均為0％。內(nèi)源激素分析表明，高水平內(nèi)源ABA含量、低水平GA含量以及低GA/ABA比值對(duì)維持花生吸脹種子的休眠狀態(tài)有積極作用。休眠態(tài)種子與乙烯利解除休眠種子相比較，乙烯利解除休眠種子的內(nèi)源GA含量迅速上升，

3、ABA含量下降，GA/ABA比值迅速上升。
　　2.利用RNA-seq技術(shù)對(duì)花生吸脹休眠態(tài)種子BO2(CK)、乙烯利處理吸脹休眠態(tài)種子2.5h AE1、種子露白AE2、種子萌發(fā)AE3四個(gè)不同時(shí)期的樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，得到374006個(gè)長(zhǎng)度大于200bp的轉(zhuǎn)錄本，大小471Mb;得到121412個(gè)Unigenes，大小94Mb。BO2(CK)，AE1，AE2，AE3四個(gè)文庫(kù)中分別獲得102845，104546，111535和1104

4、89Unigenes。通過(guò)與BO2(CK)相比較（Fold Change≥2 and Pvalue≤0.05），AE1中有1555個(gè)unigenes上調(diào)表達(dá)，472unigenes下調(diào)表達(dá);AE2中有4586個(gè)unigenes上調(diào)表達(dá)，2335unigenes下調(diào)表達(dá);AE3中有4192個(gè)unigenes上調(diào)表達(dá)，2967unigenes下調(diào)表達(dá)。篩選到四個(gè)樣品中的共表達(dá)差異unigenes為1206個(gè)，通過(guò)聚類分析將差異表達(dá)unige

5、nes聚類分成9組。其中赤霉素20氧化酶、脫落酸8'羥化酶、EREBP-like因子、ACC氧化酶、熱激蛋白等綜合調(diào)控花生種子休眠解除以及萌發(fā)。通過(guò)熒光定量進(jìn)行了驗(yàn)證，證實(shí)轉(zhuǎn)錄組分析可靠。
　　3.通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得生長(zhǎng)素抑制蛋白基因（AhARP），該基因全長(zhǎng)為918 bp，基因開(kāi)放閱讀框?yàn)?63 bp，編碼121個(gè)氨基酸，推導(dǎo)出蛋白質(zhì)分子量為13.44kD，理論等電點(diǎn)pI9.64。序列比對(duì)表明該序列與花生生長(zhǎng)素抑制蛋白基因(AA

6、Z20292.1)一致。熒光定量PCR結(jié)果表明，AhARP基因在種子休眠階段表達(dá)量較高，種子休眠解除后表達(dá)量降低;乙烯利解除吸脹種子休眠過(guò)程中，AhARP基因受到明顯誘導(dǎo);說(shuō)明AhARP基因可能與花生種子休眠有關(guān)。
　　4.基于轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果，檢測(cè)到15個(gè)與GA、40個(gè)與ABA、60個(gè)與ETH、56個(gè)與auxin相關(guān)的unigenes在花生種子休眠解除過(guò)程中表現(xiàn)顯著差異表達(dá)。熒光定量PCR結(jié)果顯示，ABA合成關(guān)鍵基因AhNCED2

7、和代謝關(guān)鍵基因AhCYP707A1在種子休眠解除過(guò)程中均受外源乙烯利誘導(dǎo)，表達(dá)差異顯著;在休眠和無(wú)休眠種子吸脹萌發(fā)過(guò)程中，AhNCED2和AhCYP707A1的表達(dá)趨勢(shì)不同，AhNCED2對(duì)于種子休眠維持發(fā)揮積極作用，而AhCYP707A1對(duì)于種子休眠解除發(fā)揮積極作用。獲得了乙烯合成途徑中的關(guān)鍵基因AhACO1，GeneBank中登錄號(hào)為KP298003。熒光定量PCR結(jié)果表明AhACO1基因受到乙烯利誘導(dǎo)表達(dá);休眠種子吸脹過(guò)程中AhA