國產(chǎn)進口兩種試劑檢測不同基因型HBV DNA結(jié)果比較與兩種不同HBV基因型檢測方法比較.pdf

1、全球約3.5億人被感染慢性乙型肝炎病毒，慢性乙型肝炎易引起肝硬化及肝癌，嚴(yán)重威脅人類健康。慢性乙型肝炎的治療對肝硬化及肝癌的防治具有重要意義。以前對乙型肝炎的診斷及病情檢測多使用生化學(xué)免疫學(xué)指標(biāo)，近年來分子生物學(xué)技術(shù)也廣泛應(yīng)用于乙型肝炎的臨床診療，如乙型肝炎病毒核酸定量檢測和乙型肝炎病毒基因分型檢測。目前乙型肝炎病毒定量檢測多使用實時熒光PCR方法，其對于慢性乙型肝炎患者的診斷、患者治療時機的決定以及治療中治療后療效的評估及預(yù)后判斷具有

2、重要意義。本課題旨在針對不同HBV分型，比較某國產(chǎn)實時熒光定量PCR(FQ-PCR)試劑與羅氏COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan(CAP/CTM)方法檢測乙型肝炎病毒(HBV)DNA的結(jié)果，找出國產(chǎn)試劑與進口試劑在敏感度、特異度方面的差距，為提高國產(chǎn)試劑性能打下理論基礎(chǔ)。本研究還使用sanger雙脫氧測序法(HBV基因分型的金標(biāo)準(zhǔn))商品試劑盒和基于sanger雙脫氧測序法自設(shè)計實驗體系對反向雜交芯片法進行了驗證，以

3、研究此方法可靠性如何，是否可用于臨床HBV病毒分型檢測。
　　本文研究內(nèi)容如下:
　　(1)抽取72份慢性乙型肝炎血清標(biāo)本，采用COBAS Amplicor的FQ-PCR試劑(A)和國產(chǎn)實時FQ-PCR試劑(B)對血清標(biāo)本進行HBV-DNA對比檢測，分析針對不同HBV分型樣本時，使用COBAS Amplicor檢測結(jié)果來評價國產(chǎn)試劑的敏感度、特異度及與試劑A的相關(guān)性。結(jié)果:A、B兩種試劑檢測結(jié)果總體相關(guān)性良好(r=0.94)

4、，定量檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。A、B兩種試劑檢測低載量樣本時，相關(guān)系數(shù)較低(r=0.31)，B試劑在檢測低載量樣本時可靠度較差。A、B兩試劑檢測不同基因型別樣本結(jié)果相關(guān)性較好(r＞0.85)，結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　(2)對所抽取72份HBV病毒血清樣本進行HBV分型（反向斑點雜交芯片法），再從72份樣本中隨機選取部分（20個樣品）分別用sanger測序法商品試劑盒體系和自設(shè)計實驗體系進行雙重驗證，研究兩種病

5、毒基因分型方法差異，并在NCBI上進行分型比對。結(jié)果:PCR反向斑點雜交芯片法與sanger雙脫氧測序法檢測相符率高，可用于臨床HBV病毒分型檢測。
　　(3)根據(jù)上述實驗結(jié)果分析討論并總結(jié)進口國產(chǎn)兩種檢測試劑主要差異在于檢測低載量樣本時國產(chǎn)試劑（試劑B）可靠度低于進口試劑（試劑A），國產(chǎn)試劑（試劑B）在檢測兩例病毒載量＜104IU/mL樣本時發(fā)生漏檢（基因型分別為B型和C/E混合型），實驗漏檢率為2.7％。
　　(4)為進

6、一步研究HBV病毒分型方法，本論文自設(shè)計實驗體系檢測HBVDNA病毒分型，結(jié)果與反向雜交法商品試劑盒和直接測序法商品試劑盒相符率高，成本低，可用于臨床檢驗與科研。
　　結(jié)論:由本研究所得結(jié)果，建議國產(chǎn)試劑改良核酸提取方法，使用高得率的提取方法（如磁珠法），如有技術(shù)條件可嘗試研發(fā)機械全自動提取設(shè)備，并加大PCR整體反應(yīng)體系，引進內(nèi)標(biāo)質(zhì)控，使用保守區(qū)多對結(jié)合引物，提高試劑靈敏度可靠性與特異性，就可有望替代進口試劑，降低病人診療費用與經(jīng)