反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)檢測(cè)HBV基因型方法的建立及應(yīng)用研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)是對(duì)人類(lèi)威脅最大的病毒之一。根據(jù)全基因組>8﹪的差異，HBV基因組分為A～H八個(gè)亞型。HBV基因型分布具有明顯的地域特征。不同HBV基因型感染者具有不同的病情發(fā)展情況，對(duì)各種治療藥物的應(yīng)答也不盡相同。因此，對(duì)HBV感染病人進(jìn)行HBV基因分型具有重要的臨床意義。目前已經(jīng)有很多對(duì)HBV進(jìn)行基因分型的方法，但是絕大部分相對(duì)來(lái)說(shuō)都費(fèi)時(shí)費(fèi)力、成本較高，不利推廣使用。更重要的是，一個(gè)堿基的突

2、變就足以影響這些方法的檢測(cè)結(jié)果。 反向斑點(diǎn)雜交方法(Reverse dot blot，RDB)是一種基于PCR基礎(chǔ)之上的，并經(jīng)過(guò)不斷發(fā)展和完善的方法。反向斑點(diǎn)雜交可以區(qū)分有只一個(gè)堿基差異的序列，可以在裝備一般的醫(yī)院或?qū)嶒?yàn)室里進(jìn)行。通過(guò)流過(guò)式雜交原理的結(jié)合使用，該方法變得更加準(zhǔn)確和快速。 第一章反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)檢測(cè)HBV基因型方法的建立 目的：建立一種基于反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)的檢測(cè)HBV基因型的方法。該反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)

3、整合有最新的流過(guò)式雜交原理。所建立的方法對(duì)一個(gè)堿基突變不敏感。 方法：使用已知基因型的：HBV陽(yáng)性標(biāo)本建立反向斑點(diǎn)雜交檢測(cè)的方法。通過(guò)分析Genebank上的序列來(lái)設(shè)計(jì)引物探針。摸索確定RDB方法的最佳反應(yīng)條件。使用經(jīng)過(guò)HBV定量試劑盒定量的臨床標(biāo)本來(lái)測(cè)定該方法的特異性和靈敏度。用廣州來(lái)源的101例陽(yáng)性標(biāo)本的測(cè)定結(jié)果與多重PCR和測(cè)序方法進(jìn)行比較。 結(jié)果：通過(guò)調(diào)整雜交溫度，能使得反向斑點(diǎn)雜交對(duì)單堿基突變不敏感。所設(shè)計(jì)的探

4、針理論上可以準(zhǔn)確檢出所有Genebank上已知的HBV序列。這些探針RDB的最佳雜交溫度是45℃。標(biāo)本檢測(cè)表明，所有的HBV陰性的標(biāo)本都得到了相應(yīng)的陰性結(jié)果。該方法的檢測(cè)靈敏度為10<'3>～10<'4>拷貝/ml。該方法與多重PCR相比有84﹪的一致性，與測(cè)序相比有96﹪的一致性。 結(jié)論：建立的反向斑點(diǎn)雜交檢測(cè)HBV基因型的方法快速、可靠并且廉價(jià)。即使在一些沒(méi)有特殊裝備的醫(yī)院里，該法亦可被用來(lái)進(jìn)行臨床樣本的HBV分型檢測(cè)。

5、 第二章反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)檢測(cè)HBV基因型方法的評(píng)價(jià) 背景：HBV的DNA聚合酶缺乏校正功能，因而HBV基因組具有較高的突變率。在第一章中已經(jīng)建立了反向斑點(diǎn)雜交檢測(cè)HBV基因型的方法，該方法與其他方法比較有很好的一致性。但第一章的標(biāo)本均來(lái)源于同一醫(yī)院，地域差異不顯著，并不能體現(xiàn)HBV高突變率對(duì)所建立方法的影響，也不能體現(xiàn)該方法臨床適用的廣泛性。 目的：評(píng)價(jià)所建立的反向斑點(diǎn)雜交檢測(cè)HBV基因型方法臨床適用的廣泛性和準(zhǔn)確性

6、。 方法：用建立的反向斑點(diǎn)雜交檢測(cè)HBV基因型的方法，檢測(cè)來(lái)源于中國(guó)各省份不同醫(yī)院的723例HBV陽(yáng)性血清標(biāo)本。選取其中的HBV基因型為單型且測(cè)序結(jié)果清晰可讀的標(biāo)本，用于比較RDB方法結(jié)果和標(biāo)本測(cè)序之后用NCBI在線(xiàn)分型的結(jié)果，以及與測(cè)序后進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析的結(jié)果。分析這些標(biāo)本與所用探針的匹配情況，分析單堿基突變對(duì)RDB方法的影響程度。 結(jié)果：723例標(biāo)本HBV基因型的檢出率為97.6﹪。其中423例單型且測(cè)序結(jié)果清晰的標(biāo)

7、本，RDB與測(cè)序之后的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果完全一致。RDB與測(cè)序之后的NCBI在線(xiàn)分型結(jié)果一致性為98.8﹪(418/423)。之后分析這些標(biāo)本序列與探針差異得知，與相應(yīng)探針有1個(gè)堿基差異的標(biāo)本B型12例、C型38例，D型l例被成功分型。該方法還準(zhǔn)確檢出了1例與C型探針差異一個(gè)堿基的A型標(biāo)本，8例與A型探針差異一個(gè)堿基的C型標(biāo)本。 結(jié)論：本研究所建立的方法能快速準(zhǔn)確地對(duì)中國(guó)各省份來(lái)源的HBV進(jìn)行分型。該方法有很強(qiáng)的臨床適用性，與測(cè)序

8、法比較一致性較高。該方法可以被應(yīng)用于國(guó)內(nèi)各大小醫(yī)院的臨床的HBV分型檢測(cè)。 第三章反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)檢測(cè)HBV基因型方法的應(yīng)用 背景：已經(jīng)建立的反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)檢測(cè)HBV基因型的方法具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。HBV基因型的分布具有明顯的地域特征。不同HBV基因型感染病人病情發(fā)展不同，不同的HBV基因型感染病人發(fā)展為HCC、LC的風(fēng)險(xiǎn)也不同。但其分子機(jī)制的研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。 目的：研究HBV基因型在中國(guó)的分布情況。研

9、究HBV基因型與臨床指標(biāo)的關(guān)系，研究肝癌病人中HBV基因型與其臨床指標(biāo)的關(guān)系，以期找到HBV基因型引起HCC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的分子機(jī)制的一些線(xiàn)索。 方法：用第二章的反向斑點(diǎn)雜交方法檢測(cè)：HBV基因型。檢測(cè)了706例分別來(lái)自中國(guó)各省份的HBV陽(yáng)性血清，用于分析中國(guó)各地HBV基因型的分布情況。用卡方檢驗(yàn)fisher精確概率法，分析145例有HBV陽(yáng)性病人的HBV基因型與年齡、性別、HBeAb、HBeAg、HBV-DNA水平以及臨床診斷之間的

10、相關(guān)關(guān)系：分析58例肝癌患者HBV基因型與一些臨床指標(biāo)的關(guān)系。這些臨床指標(biāo)還包括一些腫瘤標(biāo)記物。 結(jié)果：證實(shí)HBV在中國(guó)主要以B、c型分布為主。D型主要分布在新疆地區(qū)。145例HBV陽(yáng)性病人的分析結(jié)果表明，HBV基因型分布與年齡、性別、HBeAb、HBeAg等臨床指標(biāo)的關(guān)聯(lián)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但與HBV-DNA水平的關(guān)聯(lián)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即不同HBV基因型的HBV-DNA的水平差異顯著(p=0.000338)。58例HCC患者的研究結(jié)果表

11、明，：HBV基因型與腫瘤包膜、病灶數(shù)量、肝炎史與否、浸潤(rùn)與否、血管侵入與否、飲酒史、腫瘤家族史、是否轉(zhuǎn)移、臨床分期、ALT水平、AST水平等臨床指標(biāo)的關(guān)聯(lián)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。也與腫瘤相關(guān)基因．AFP、CEA、CA125、CA19-9、Pokemon、HCCR、Caspase3、Suvivine、Midkine等表達(dá)的關(guān)聯(lián)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但與吸煙史的關(guān)聯(lián)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即HBV基因型在是否有吸煙史病人中的分布差異顯著(P=0.0236)。