siRNA阻斷兔骨髓基質(zhì)細胞內(nèi)PPARγ基因表達的實驗研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、研究目的: 酒精性股骨頭壞死(osteonecrosis of the femoral head,ONFH)發(fā)病率高。目前,酒精性O(shè)NFH早期病例采取保守治療,晚期病例行人工髖關(guān)節(jié)置換術(shù)。但是,保守的療法效果差,手術(shù)療法有很多并發(fā)癥。近年來的研究顯示:在體外實驗中酒精可以通過增加骨髓基質(zhì)細胞(marrow stromal cells,MSCs)內(nèi)過氧化物酶體增殖子活化受體γ(peroxisome proliferator-act

2、ivated receptor-γ,PPAR γ)基因的表達而誘導(dǎo)MSCs分化為脂肪細胞,使成骨分化減少,這與體內(nèi)酒精中毒導(dǎo)致的股骨頭內(nèi)脂肪細胞增加、骨質(zhì)疏松的病理改變一致。PPAR γ是一種成脂轉(zhuǎn)錄因子,能夠誘導(dǎo)脂肪前體細胞成熟為脂肪細胞,它在前脂肪細胞中不表達,而在脂肪分化過程中表達,并先于大多數(shù)脂肪基因的表達。沒有PPARγ時,前脂肪細胞難以分化為脂肪細胞。在成脂作用和脂肪細胞分化中,PPARγ起著關(guān)鍵性調(diào)節(jié)作用。若MSCs內(nèi)PP

3、ARγ表達,則其分化為脂肪細胞,抑制PPARγ活性可以抑制MSCs的脂肪分化,保持MSCs分化為成骨細胞。對酒精性O(shè)NFH的發(fā)病機制從基因水平給出了解釋。目前RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù)逐漸成熟,利用此技術(shù)有可能干擾或阻斷酒精誘導(dǎo)MSCs內(nèi)PPARγ基因的表達,從而抑制酒精誘導(dǎo)MSCs分化為脂肪細胞,保持其成骨分化,促進骨修復(fù)和重建,達到針對發(fā)病起始環(huán)節(jié)防治酒精性O(shè)NFH的目的。故本實驗旨在觀察采用RNA

4、i技術(shù)阻斷酒精誘導(dǎo)MSCs內(nèi)PPAR γ基因的表達的效果,為在發(fā)病起始環(huán)節(jié)防治酒精性O(shè)NFH提供可靠的科學(xué)依據(jù)。 第一部分:針對PPAR γ siRNA載體的構(gòu)建和病毒包裝 方法: 利用Takara、Ambion和promega siRNA靶序列分析設(shè)計系統(tǒng),掃描兔PPARγ基因(AF013266),依據(jù)siRNA靶序列設(shè)計原則,BLAST分析與其他基因家族的同源性。最后確定3個編碼序列是19個堿基的siRNA靶

5、序列,同時隨機組合出一條無關(guān)對照siRNA序列。分別合成4對編碼短發(fā)卡RNA序列的DNA單鏈,兩端分別加入BamHⅠ和XhoⅠ的酶切位點。將合成的4對發(fā)卡DNA分別退火,然后克隆入T載體pGEM-T;經(jīng)過T7/SP6為引物的PCR擴增篩選,得到pGEM-T-siPPARγ-1、pGEM-T-siPPAR γ-2、pGEM-T-siPPAR γ-3和pGEM-T-C。BamHI 和 XhoⅠ雙酶切pGEM-T-siPPAR γ-1、pGE

6、M-T-siPPAR γ-2、pGEM-T-siPPAR γ-3、pGEM-T-C和siRNA載體pRNAT-U6.2/Lenti,分別回收雙粘發(fā)卡DNA片段和線形化雙粘siRNA載體;將4個雙粘發(fā)卡DNA片段分別亞克隆入siRNA載體,通過BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切和PCR篩選、鑒定和DNA序列分析,得到質(zhì)粒型siRNA表達載體pRNAT-U6.2/Lenti-siPPAR γ-1,pRNAT-U6.2/Lenti-siPPAR γ-

7、2,pRNAT-U6.2/Lenti-siPPAR γ-3,和pRNAT-U6.2/Lenti-siPPAR γ-C。采用脂質(zhì)體Lipofectamine<'TM> 2000包裹構(gòu)建的siRNA表達載體和輔助包裝載體,共轉(zhuǎn)染293FT細胞,產(chǎn)生含有表達siRNA的Lentivirus病毒顆粒:最后對其進行純化和病毒滴度測定。 結(jié)果: 1.PPAR γ siRNA靶區(qū)段篩選:篩選得到針對兔PPAR γ基因的3個siRNA靶

8、序列,分別是GGCCTCCTTGATGAATAAA(677-695),GCAGGAGCAGAGCAAAGAA(497-515)和GGAAAGACGACAGACAAAT(402-420)。 2.發(fā)卡DNA片段的克?。篜PAR γ和對照發(fā)卡樣siRNA單鏈DNA退火產(chǎn)物與pGEM-T Easy連接后,轉(zhuǎn)化JM109,藍白篩選后隨機各選擇10菌落以T7/SP6作為引物進行PCR擴增,都得到有為252bp擴增片段的陽性克隆。 3

9、.亞克隆入siRNA表達載體:連接pRNAT-U6.2/Lenti-siPPAR γ-1、2、3和pRNAT-U6.2/Lenti-siPPAR γ-C轉(zhuǎn)化JM109,在Amp<'+>LB平板上培養(yǎng),都長出10個以上陽性菌落;利用pRNAT-U6.2/Lenti插入鑒定引物擴增鑒定,4種亞克隆重組子都有擴增片段為560bp的陽性克?。环謩e提取重組質(zhì)粒,用BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切對重組質(zhì)粒進行鑒定,證實得到pRNAT-U6.2/Lent

10、i-siPPAR-1、2、3和pRNAT-U6.2/Lenti-siPPAR γ-C。對插入序列DNA測序結(jié)果與設(shè)計比較,完全一致。 4.表達siRNA的Lentivirus病毒包裝:亞克隆重組子與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細胞,得到滴度為2.1×10<'7>IU/ml-4.3×10<'7> IU/ml的表達siRNA的Lentivirus病毒顆粒。 第二部分:siRNA阻斷酒精誘導(dǎo)兔骨髓基質(zhì)細胞內(nèi)PPAR γ表達的實驗研

11、究 方法: 選用新西蘭白兔取骨髓,制備兔MSCs。實驗共分7組,對照組(Normal,N):單純的MSCs;模型組(Model,M):單純酒精誘導(dǎo);感染空載體組(Control 0,C0):酒精誘導(dǎo)同時感染空載體pRNAT-U6.2/Lenti包裝產(chǎn)生的Lentivirus病毒;感染無關(guān)siRNA組(Control 1,C1):酒精誘導(dǎo)同時感染pRNAT-U6.2/Lenti-siPPAR γ-C包裝產(chǎn)生的Lontivi

12、rus病毒;干擾1、2、3組(siRNA1,S1、siRNA 2,S2、siRNA 3,S3.):酒精誘導(dǎo)同時感染pRNAT-U6.2/Lenti-siPPARγ-1、2、3包裝產(chǎn)生的Lentivirus病毒。第二代MSCs接種子6孔培養(yǎng)板(或培養(yǎng)瓶)中,每孔加入包裝病毒,病毒量相當于每個MSCs感染10個包裝病毒,感染12h,然后換完全高糖DMEM培養(yǎng)基,同時在需要酒精誘導(dǎo)的各組中加入酒精,酒精終濃度為0.09mel/L,進行誘導(dǎo)。在

13、以后的培養(yǎng)中,換液時對需要酒精誘導(dǎo)的各組都加入酒精,酒精終濃度為0.09 mol/L。逐日用倒置顯微鏡觀察MSCs的形態(tài)及生長情況。在酒精誘導(dǎo)3、5、7、14天時,均用熒光定量RT-PCR和Western-blot方法分別檢測各組MSCs內(nèi)PPAR γ mRNA表達水平和蛋白表達量。在酒精誘導(dǎo)14天時,對培養(yǎng)MSCs用蘇丹Ⅲ染色,進行脂肪細胞計數(shù);用相應(yīng)試劑盒檢測MSCs骨鈣素分泌量、細胞的ALP活性和細胞的TG含量。所有實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)

14、±標準差(X±S)表示,采用SPSS12.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,多組間比較采用單因素方差分析,檢驗水準a=0.05。 結(jié)果 1.包裝病毒感染觀察:熒光顯微鏡觀察可見,感染空載體組、感染無關(guān)siRNA組、干擾1組、干擾2組和干擾3組的MSCs細胞,幾乎100%都可發(fā)出綠色熒光,而對照組和模型組未見任何熒光,顯示包裝病毒感染MSCs效率很高。 2.熒光定量RT-PCR:模型組、感染空載體組、感染無關(guān)siRNA組在酒精

15、誘導(dǎo)3天后PPAR γ mRNA表達量就迅速升高,持續(xù)酒精誘導(dǎo)下,一直保持高水平表達;對照組在14天的培養(yǎng)中,細胞內(nèi)PPAR γ mRNA表達水平相對恒定,保持一個較低的水平;3個干預(yù)組都能夠不同程度的抑制細胞PPAR γ mRNA的表達,其抑制效果干擾1組>干擾3組>干擾2組,抑制效果隨時間的延續(xù)而逐漸減弱。 3.Western_b10t:酒精誘導(dǎo)3、5、7、14天,免疫印跡顯示,對照組PPAR γ蛋白印跡較淺,而模型組、感染

16、空載體組和感染無關(guān)siRNA組PPAR γ蛋白印跡較對照組深;干擾1組、干擾2組和干擾3組PPARγ蛋白印跡較對照組淺,表明包裝siRNA病毒能夠有效地抑制MSCs內(nèi)PPAR γ蛋白的表達水平。 4.脂肪細胞數(shù)和TG含量:酒精誘導(dǎo)14天,與對照組比較,模型組、感染空載體組、感染無關(guān)siRNA組中脂肪細胞數(shù)多、細胞TG含量升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與對照組比較,干擾1組、干擾2組和干擾3組的脂肪細胞數(shù)接近、細胞內(nèi)TG

17、含量稍高,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 5.骨鈣素分泌和ALP活性:酒精誘導(dǎo)14天,與對照組比較,模型組、感染空載體組和感染無關(guān)siRNA組中細胞分泌骨鈣素減少、細胞ALP活性減低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與對照組比較,干擾1組、干擾2組和干擾3組中細胞分泌骨鈣素量接近、細胞ALP活性稍低,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 結(jié)論: 1.成功構(gòu)建3個靶向兔PPAR γ基因的真核siRNA載體,通過

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