體外誘導兔骨髓基質干細胞分化為成骨細胞的實驗研究.pdf

1、目的：通過密度梯度離心法分離兔骨髓基質干細胞（Bone marrowstromal stem cells，BMSCs）行體外培養(yǎng)，探討B(tài)MSCs體外培養(yǎng)后的生物學特性，并誘導其向成骨細胞方向分化，觀察其成骨過程。方法：用2％戊巴比妥鈉以30mg/kg麻醉家兔后處死，分離雙側股骨、脛骨骨髓，利用密度梯度離心法結合貼壁培養(yǎng)分離純化兔BMSCs，制備單細胞懸液，接種于含10％胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)液中，通過傳代擴增，進一步去除未貼壁的細胞

2、，待細胞鋪滿瓶底近80％后，加入0.25％胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。取生長良好的對數(shù)期第3代細胞，以1×107/L的細胞濃度接種于預置蓋玻片的24孔培養(yǎng)板內。實驗細胞分為2組：實驗組使用成骨細胞誘導液，定向誘導骨髓基質干細胞向成骨細胞分化；對照組等量加入含10％胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。兩組細胞持續(xù)培養(yǎng)，進行細胞成骨分化觀察。主要觀察指標：在倒置顯微鏡下觀察細胞生長及增殖情況，流式細胞儀檢測細胞表面標志物的表達，透射電鏡觀察細胞

3、的超微結構，Ⅰ型膠原免疫組織化學染色，VON KOSSA染色和堿性磷酸酶染色檢測向成骨細胞誘導分化情況，并作統(tǒng)計分析。結果：用兔淋巴細胞分離液梯度離心結合貼壁法從骨髓中分離單個核細胞，接種于含10％胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)液。在接種后48小時貼壁，細胞形態(tài)為橢圓形，多角形及短梭形；72小時后出現(xiàn)散在的紡錘狀貼壁細胞；10-14天后形成克隆。BMSCs貼壁稀疏時，長梭形細胞的兩極朝向不規(guī)則，細胞排列紊亂，細胞之間往往通過突起相連接，約3

4、周出現(xiàn)致密的貼壁細胞層，此時細胞的兩極開始有規(guī)律的排列成束狀，有的呈漩渦狀。經(jīng)傳代擴增，細胞進一步純化，細胞形態(tài)為均一的長梭形并呈漩渦狀排列，而且生長速率加快，P1代細胞群體倍增時間約為37小時。P3代細胞生長潛伏期為3-4天，第4-6天進入對數(shù)生長期，2周后進入平臺期。流式細胞儀檢測CD34，CD45陰性，CD44陽性。電鏡顯示BMSCs胞核呈類圓形或不規(guī)則型，核膜清晰，有1-2個核，染色質較粗，胞質中細胞器豐富，細胞表面有絨毛。用成

5、骨細胞誘導液定向誘導第3代BMSCs第7天，可觀察到少許細胞由梭形變?yōu)槎嘟切?。隨著時間的增長，多角形的細胞逐漸增多并聚集成團，14天后Von Kossa染色出現(xiàn)鈣結節(jié)，堿性磷酸酶染色呈陽性。對照組未見鈣化結節(jié)，堿性磷酸酶染色呈陰性。經(jīng)誘導后的細胞堿性磷酸酶染色明顯，胞質中陽性反應呈現(xiàn)灰黑色顆粒或塊狀沉淀，堿性磷酸酶活性部位呈棕黑色。Vonkossa染色可見黑色的礦化結節(jié)顆粒，顆粒大小不均一，提示有礦化基質沉積。骨誘導培養(yǎng)三周，免疫組化S

6、P法可檢測到Ⅰ型膠原表達，在結節(jié)周圍呈黃褐色，而對照組則未能表達。結論：（1）將兔骨髓基質干細胞進行體外培養(yǎng)，能夠在較短的時間內獲得大量較高純度的干細胞，且周期短，重復性好，可作為組織工程學中種子細胞的重要來源。（2）地塞米松在骨髓基質細胞向成骨細胞轉化過程中所誘導的實驗組在細胞在形態(tài)和生物學特性上都較對照組更具有成骨細胞的特征，其ALP得活性和形成鈣結節(jié)的能力都強于對照組細胞。（3）BMSCs在體外適合的條標件下可以向成骨細胞轉化，并