GhPR5K調(diào)控棉花抗黃萎病的分子機制.pdf

1、黃萎?。╒erticillium dahliae）是我國乃至世界棉花生產(chǎn)上的重要病害，寄主的抗病機制不清是病害有效控制的瓶頸問題。本文通過對抗病品種和感病品種經(jīng)黃萎病菌誘導(dǎo)前后根部蛋白的磷酸化分析，獲得一個差異顯著的類受體蛋白激酶GhPRSK。利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)技術(shù)驗證其在棉花抗黃萎病過程中的功能，并進(jìn)一步分析其防御反應(yīng)機制，篩選其互作的蛋白。取得的主要結(jié)果如下:
　　1.利用黃萎病菌Vd080侵染抗病品種中植棉2

2、號和感病品種冀棉11號，進(jìn)行修飾蛋白質(zhì)組定量分析，共檢測到1716個磷酸化蛋白，其中639個顯著差異的蛋白，主要涉及到植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、MAPK信號通路、AMPK信號通路、植物病原互作及mTOR信號通路等。其中，Gh_D04G1868在中植棉2號處理組與對照組間的差異倍數(shù)最高，達(dá)到了12.69，而在冀棉11號處理組與對照組間的差異不顯著。同源性比較發(fā)現(xiàn)Gh_D04G1868與擬南芥的病程相關(guān)蛋白激酶AtPR5K相似性達(dá)到了84.7％

3、，因此將其命名為GhPR5K。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，接種Vd080后，GhPR5K在中植棉2號中的表達(dá)量大幅度提高，初步推斷GhPR5K參與了棉花對黃萎病的防御反應(yīng)。
　　2.基因克隆得到了GhPR5K全長。其CDS全長1887bp，編碼628個氨基酸，位于Dt_chr12染色體上。蛋白序列分析表明，在252-274堿基區(qū)內(nèi)有一個跨膜區(qū)，N端有一個信號肽，C端有一段絲氨酸/蘇氨酸富集區(qū)域。
　　3.利用VIGS技術(shù)，成功地在棉花中

4、沉默該基因。接種試驗表明，沉默植株葉片大量變黃、萎蔫，甚至脫落、枯死;而對照植株葉片變黃、萎蔫明顯較輕，沒有嚴(yán)重的脫落和枯死植株。接種后20d和25d，TRV∶GhPR5K的病情指數(shù)分別為19.5和54.2，顯著高于對照植株的10.3和25.2，表明GhPR5K正調(diào)控棉花對黃萎病的抗性。進(jìn)一步遺傳轉(zhuǎn)化煙草，獲得在選擇性培養(yǎng)基上表現(xiàn)為陽性的煙草植株12株。
　　4.將TRV∶00和TRV∶GhPR5植株接種Vd080，觀察其防御反應(yīng)

5、，分析防御相關(guān)基因的表達(dá)量。結(jié)果表明，與TRV∶00植株相比，TRV∶GhPR5K植株葉片中活性氧爆發(fā)減少、死細(xì)胞數(shù)較多，莖部木質(zhì)化程度減弱，莖部定殖有更多的棉花黃萎病菌，維管束褐變程度顯著加重。qRT-PCR分析表明，與TRV∶00相比，PR基因在TRV GhPR5K植株均顯著下降，4CL、CHI、PAL、POD、CAD、C4H1最高分別下降70.95％、43.57％、55.33％、43.47％、78.09％和71.89％。表明TRV