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文檔簡介
1、目的:探討孤兒核受體Nur77在小膠質(zhì)細(xì)胞激活中的調(diào)控作用及機(jī)制,并研究其抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥對多巴胺能神經(jīng)元毒性的保護(hù)作用。
方法:用MPTP誘導(dǎo)小鼠帕金森?。≒arkinson’s disease,PD)模型,免疫組織熒光法觀察Nur77在小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞上的表達(dá)。用LPS激活原代小膠質(zhì)細(xì)胞和BV2小膠質(zhì)細(xì)胞系模擬體內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞激活內(nèi)環(huán)境,觀察Nur77在小膠質(zhì)細(xì)胞激活中表達(dá)變化和調(diào)控作用。過表達(dá)Nur77慢病毒
2、感染BV2細(xì)胞,用Griess法檢測LPS誘導(dǎo)激活后NO釋放量,實(shí)時定量PCR(Real-time quantiative PCR,q-RCR)和蛋白免疫印跡(Western Blot,WB)檢測炎性因子iNOS、COX-2、IL-1β和TNF-α表達(dá)變化。Nur77敲低慢病毒感染BV2細(xì)胞,LPS誘導(dǎo)激活后觀察炎性因子的變化。同時預(yù)處理給予Nur77特異性激動劑CsnB,研究其對小膠質(zhì)細(xì)胞激活的調(diào)控作用。表達(dá)NF-κB轉(zhuǎn)錄報(bào)告基因的B
3、V2細(xì)胞過表達(dá)Nur77或者用CsnB預(yù)處理,探討Nur77對LPS誘導(dǎo)的NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的影響。WB檢測過表達(dá)Nur77或者CsnB對激活的小膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB核轉(zhuǎn)位調(diào)控作用,及對NF-κB抑制蛋白IκBα磷酸化水平和降解水平的影響;同時探討過表達(dá) Nur77或 CsnB對激活小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)MAPK通路活化的調(diào)控作用。用BV2小膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基與MN9D多巴胺能神經(jīng)元共培養(yǎng)模擬PD發(fā)病時小膠質(zhì)細(xì)胞激活對神經(jīng)元的損傷,流式細(xì)胞儀檢測神
4、經(jīng)元的凋亡水平,觀察Nur77對神經(jīng)炎癥引起的神經(jīng)毒性保護(hù)作用。
結(jié)果:Nur77在小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá),在PD小鼠模型中黑質(zhì)致密部多巴胺神經(jīng)元損傷伴隨激活的小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Nur77熒光強(qiáng)度降低。原代培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞和BV2小膠質(zhì)細(xì)胞在LPS激活后,Nur77 mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)并且呈時間依賴性。BV2細(xì)胞過表達(dá)Nur77可以顯著抑制LPS激活小膠質(zhì)細(xì)胞后炎性因子iNOS、COX-2、IL-1β和TNF-α的表達(dá),進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)預(yù)處理
5、給予Nur77激動劑CsnB可以劑量依賴性抑制炎性因子釋放。相反,敲低Nur77后上調(diào)LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)炎性因子表達(dá)。Nur77抗炎作用機(jī)制與抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄及其核轉(zhuǎn)位,減少IκBα磷酸化和降解,并且抑制MAPK中p38磷酸化水平有關(guān)。小膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Nur77可以減輕小膠質(zhì)細(xì)胞激活后對MN9D細(xì)胞的神經(jīng)毒性。
結(jié)論:明確Nur77在小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá),并且對小膠質(zhì)細(xì)胞激活具有重要的調(diào)控作用,過表達(dá)Nu
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