甘油激酶與核受體Nur77相互作用及其對肝臟脂代謝調(diào)控研究.pdf

1、本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，GK與核孤兒受體Nur77存在蛋白質(zhì)相互作用。近年研究表明，Nur77和GK與肝臟脂代謝過程存在密切聯(lián)系，提示GK與Nur77可能通過蛋白質(zhì)相互作用對肝臟脂代謝進行調(diào)控。本文對GK和Nur77相互作用進行深入研究，揭示其對肝臟脂代謝調(diào)控功能的影響，為脂代謝調(diào)控和代謝類疾病的發(fā)病機制和治療提供線索；同時為后續(xù)動物實驗建立基礎，構建了GK-pCDH過表達慢病毒和GK-pSicoR干涉慢病毒載體，獲得穩(wěn)定過表達/干涉GK的

2、慢病毒。
　　本文首先利用免疫共沉淀技術，對GK與Nur77相互作用及作用域進行確認。進而利用Nur77對熒光素酶報告基因ApoA5promoter的轉錄激活作用，檢測GK對Nur77的轉錄激活活性的影響。同時，選取幾個受Nur77調(diào)控的脂代謝相關基因，在人肝細胞系L02及小鼠體內(nèi)同時轉染GK和Nur77的表達載體，進行實時定量PCR實驗，檢測各基因在肝中mRNA水平表達狀況。此外，將GK的CDS序列構建到pCDH慢病毒質(zhì)粒中，并

3、將有效干涉GK的siRNA序列構建到pSicoR慢病毒質(zhì)粒中，293T細胞包裝獲得慢病毒，檢測慢病毒滴度，并對GK慢病毒過表達/干涉效果進行檢測。
　　由免疫共沉淀實驗證實GK與Nur77存在相互作用，GK的N端和C端是相互作用的結構域。GK使Nur77報告基因轉錄活性降低，激活倍數(shù)可3倍降低至0.5倍，抑制效果明顯，且不依賴于GK的激酶活性。Real-timePCR結果顯示Nur77對Srebp-1c、Fas、Gpam和Acac