毛蕊異黃酮對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的治療作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　潰瘍性結(jié)腸炎是由于免疫異常導(dǎo)致的腸道炎癥性疾病，毛蕊異黃酮具有調(diào)節(jié)免疫、抗炎等生物學(xué)活性。本研究針對毛蕊異黃酮對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的作用進(jìn)行研究，探討毛蕊異黃酮對潰瘍性結(jié)腸炎治療作用及其潛在的作用機(jī)制。
　　方法:
　　在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，溶血率檢測方法檢測20μM、40μM、80μM、160μM和320μM等不同濃度的毛蕊異黃酮對小鼠紅細(xì)胞的溶血作用，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)方法檢測不同濃度的毛蕊異黃酮對小鼠巨噬細(xì)胞株R

2、aw264.7細(xì)胞增殖的影響作用，根據(jù)溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果和細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用毛蕊異黃酮的劑量。實(shí)時(shí)定量PCR檢測毛蕊異黃酮影響脂多糖誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞株細(xì)胞中炎癥因子IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)程度。酶聯(lián)免疫吸附方法檢測毛蕊異黃酮影響脂多糖誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞株細(xì)胞中炎癥因子IL-6和TNF-α的含量。流式細(xì)胞術(shù)檢測毛蕊異黃酮對脂多糖誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞株細(xì)胞中活性氧(ROS)的影響作用。免疫印跡方法檢測毛蕊異黃酮對脂多

3、糖誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞株細(xì)胞中NF-κB通路和MAPK通路的影響作用。
　　建立葡聚糖硫酸鈉(DSS)和三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)的兩種潰瘍性結(jié)腸炎實(shí)驗(yàn)動物模型。Balb/c品系雄性小鼠共35只，按體重隨機(jī)分為5組，每組7只，分別為正常對照組、0.5％羧甲基纖維素鈉溶劑對照組、25mg/kg毛蕊異黃酮組、50mg/kg毛蕊異黃酮組、50mg/kg5-氨基水楊酸藥物對照組。葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎實(shí)驗(yàn)動物模型，小鼠連續(xù)給予含2

4、.5％DSS的飲用水7天后，繼續(xù)給予正常飲用水3天，建立潰瘍性結(jié)腸炎實(shí)驗(yàn)動物模型，從造模第一天起，每天正常對照組給予連續(xù)10天正常飲用水并且應(yīng)用0.5％羧甲基纖維素鈉灌胃，模型溶劑對照組給予DSS以及0.5％羧甲基纖維素鈉灌胃，治療組分別為給予DSS以及25mg/kg毛蕊異黃酮或者50mg/kg毛蕊異黃酮灌胃，藥物對照組給予DSS以及50mg/kg5-氨基水楊酸灌胃。三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎實(shí)驗(yàn)動物模型，經(jīng)小鼠肛門導(dǎo)管注射100μ

5、1的2.5％TNBS及50％乙醇溶液，建立潰瘍性結(jié)腸炎實(shí)驗(yàn)動物模型，造模第一天，正常對照組給予無TNBS的100μl50％乙醇溶液以及0.5％羧甲基纖維素鈉灌胃，模型組給與TNBS以及0.5％羧甲基纖維素鈉灌胃，治療組分別為給予TNBS以及25mg/kg毛蕊異黃酮或者50mg/kg毛蕊異黃酮灌胃，藥物對照組給予TNBS以及50mg/kg5-氨基水楊酸灌胃。自建立潰瘍性結(jié)腸炎實(shí)驗(yàn)動物模型起，每日連續(xù)觀察及記錄小鼠生存狀況、測量體重以及疾病

6、活動指數(shù)，直至造模結(jié)束。造模結(jié)束后處死各組實(shí)驗(yàn)動物，取實(shí)驗(yàn)小鼠大腸組織，觀察大腸組織病變狀況，測量及記錄大腸長度。實(shí)驗(yàn)小鼠大腸組織切片經(jīng)蘇木精-伊紅染色評價(jià)病理改變狀況。提取實(shí)驗(yàn)小鼠大腸組織總RNA，實(shí)時(shí)定量PCR檢測炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-1β和MCP-1的mRNA表達(dá)程度，酶聯(lián)免疫吸附方法檢測實(shí)驗(yàn)小鼠大腸組織中炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-1β和MCP-1的含量。超氧化物歧化酶和丙二醛試劑盒檢測實(shí)驗(yàn)小鼠大腸組織中超

7、氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)的含量。免疫印跡法檢測實(shí)驗(yàn)小鼠大腸組織中NF-κB通路中IKKα、IKKβ、IκBα和p65總蛋白水平及其磷酸化水平，免疫印跡法檢測實(shí)驗(yàn)小鼠大腸組織中MAPK通路中JNK、p38和Erk1/2總蛋白水平及其磷酸化水平。
　　選取輕度及中度潰瘍性結(jié)腸炎患者，治療組給予靜脈滴注黃芪注射液及口服美沙拉嗪腸溶片治療，對照組給予口服美沙拉嗪腸溶片治療。記錄患者病情變化，根據(jù)療效評判標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)治療效果

8、，檢測患者的血紅蛋白(HB)濃度、白蛋白(ALB)濃度、C反應(yīng)蛋白(CRP)濃度、紅細(xì)胞沉降速率(ESR)、IL-6、TNF-α、SOD和MDA等各項(xiàng)血液指標(biāo)，觀察黃芪注射液在臨床治療中對潰瘍性結(jié)腸炎患者的治療作用。
　　結(jié)果:
　　在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，小鼠紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)顯示160μM和320μM毛蕊異黃酮對小鼠紅細(xì)胞有較強(qiáng)的溶血作用，160μM和320μM毛蕊異黃酮處理小鼠巨噬細(xì)胞株細(xì)胞可抑制細(xì)胞增殖，綜合毛蕊異黃酮對小鼠紅

9、細(xì)胞的溶血率檢測結(jié)果和對小鼠巨噬細(xì)胞株細(xì)胞抑制率檢測結(jié)果，選擇應(yīng)用20μM、40μM和80μM毛蕊異黃酮用于研究毛蕊異黃酮體外抗炎作用及其機(jī)制。40μM和80μM毛蕊異黃酮處理小鼠巨噬細(xì)胞株細(xì)胞可抑制脂多糖誘導(dǎo)的炎癥因子IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)水平，并且抑制IL-6和TNF-α炎癥因子的生成。40μM和80μM毛蕊異黃酮處理小鼠巨噬細(xì)胞株細(xì)胞可抑制脂多糖誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生。40μM和80μM毛蕊異黃酮可抑制脂多糖誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)

10、胞株細(xì)胞NF-κB通路中IKKα、IKKβ、IκBα和p65蛋白磷酸化，阻滯IκBα磷酸化蛋白降解，可抑制脂多糖誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞株細(xì)胞中JNK蛋白磷酸，對p38和Erk1/2磷酸化水平無影響。
　　在DSS和TNBS誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎實(shí)驗(yàn)動物模型中，50mg/kg毛蕊異黃酮和對照藥物5-氨基水楊酸可抑制DSS或TNBS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠體重下降、大腸長度減少、疾病活動指數(shù)升高。蘇木精-伊紅染色結(jié)果顯示毛蕊異黃酮可以保護(hù)潰

11、瘍性結(jié)腸炎小鼠大腸黏膜組織內(nèi)杯狀細(xì)胞及隱窩形態(tài)完整、降低黏膜損傷、減少炎癥細(xì)胞浸潤。實(shí)時(shí)定量PCR和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯不，50mg/kg毛蕊異黃酮和對照藥物5-氨基水楊酸可抑制DSS或TNBS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠大腸組織中炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-1β和MCP-1的mRNA表達(dá)水平，并且抑制IL-6、TNF-α、IL-1β和MCP-1炎癥因子的生成。50mg/kg毛蕊異黃酮和對照藥物5-氨基水楊酸可抑制DSS或TNBS誘

12、導(dǎo)的SOD活性的下降及MDA的生成。免疫印跡結(jié)果顯示，50mg/kg毛蕊異黃酮或?qū)φ账幬?-氨基水楊酸可以抑制DSS或者TNBS誘導(dǎo)的NF-κB通路中IKKα、IKKβ、IκBα和p65磷酸化水平，可以抑制MAPK通路中JNK蛋白磷酸化，對p38和Erk1/2磷酸化水平無影響。
　　臨床研究結(jié)果表明黃芪注射液對潰瘍性結(jié)腸炎患者具有明確的治療作用，經(jīng)聯(lián)合應(yīng)用美沙拉嗪腸溶片，治療組的治療有效率高于對照組，復(fù)發(fā)率低于對照組?；颊呓?jīng)治療后

13、，HB、ALB和SOD指標(biāo)的濃度增高，CRP、ESR、IL-6、TNF-α和MDA指標(biāo)的濃度降低，對照組與治療組相比HB指標(biāo)的濃度變化無顯著性差異，治療組其余的檢測指標(biāo)變化程度均大于對照組相應(yīng)的檢測指標(biāo)變化程度。
　　結(jié)論:
　　1.在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，毛蕊異黃酮可以抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中炎癥因子mRNA表達(dá)以及炎癥因子的產(chǎn)生，可以降低脂多糖誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生，其作用機(jī)制可能與阻斷NF-κB和JNK通路有關(guān)。
　　2.