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文檔簡介
1、1,8-萘酰亞胺類染料作為傳統(tǒng)的環(huán)境敏感型染料之一,以其化學(xué)易修飾、熒光易調(diào)控等優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用于熒光識別與熒光成像領(lǐng)域。面對迅速發(fā)展的單分子和超分辨熒光成像技術(shù)的需求,萘酰亞胺類染料的熒光強度和熒光穩(wěn)定性需要大幅度提高,這就需要克服水溶液中存在的扭轉(zhuǎn)的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(TICT)和氫鍵等作用對熒光的影響。借助蛋白標(biāo)簽或非天然氨基酸等新興生物分子標(biāo)記技術(shù)與生物正交反應(yīng),有機小分子熒光探針能夠?qū)崿F(xiàn)對目標(biāo)蛋白的精準(zhǔn)定位和識別。目前,萘酰亞胺類染
2、料在蛋白標(biāo)記和蛋白識別等領(lǐng)域還缺乏相應(yīng)研究,特別是亟待發(fā)現(xiàn)新的識別目標(biāo)蛋白的熒光信號響應(yīng)機制,以提高標(biāo)記蛋白或識別蛋白的靈敏度,實現(xiàn)構(gòu)建蛋白熒光探針方法上的普適性。本文以萘酰亞胺類染料的熒光構(gòu)效關(guān)系為研究基礎(chǔ),理論計算和實驗相結(jié)合為研究方法,開展了提高萘酰亞胺類染料熒光強度和光穩(wěn)定性、構(gòu)建蛋白質(zhì)標(biāo)記和識別熒光探針等方面的研究。
(1)通過氮丙啶取代基對扭轉(zhuǎn)的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(TICT)的強烈抑制,實現(xiàn)了1,8-萘酰亞胺熒光強度和
3、光穩(wěn)定性的顯著提高。氮丙啶取代的萘酰亞胺衍生物AN1實現(xiàn)了熒光量子效率的提高(水中Φ=0.43)、光穩(wěn)定性的提高和斯托克斯位移的增大(△λ=151nm)。TD-DFT理論計算表明氮丙啶對TICT的抑制機理主要是氮丙啶強的環(huán)張力(up-up構(gòu)型)導(dǎo)致了AN1的TICT態(tài)能級高于LE態(tài)能級,從而難以在激發(fā)態(tài)發(fā)生構(gòu)型的扭轉(zhuǎn)。氮丙啶抑制TICT的機制同樣適應(yīng)于其他熒光團。將氮丙啶引入到多個不同的熒光團(如NBD類、鄰苯二甲酰亞胺類、香豆素類),
4、同樣實現(xiàn)了這些熒光團在水中熒光量子效率的提高。
(2)設(shè)計合成了一系列1,8-萘酰亞胺類熒光增強型SNAP-tag熒光探針(BGAN-Aze,BGAN-Amino等),實現(xiàn)了對細(xì)胞核與線粒體內(nèi)靶蛋白的免洗熒光成像,避免了多次洗滌對細(xì)胞帶來的損傷。BGAN-Aze基于聚集誘導(dǎo)熒光淬滅機理實現(xiàn)了識別SNAP-tag后熒光顯著增強的信號響應(yīng)(~39倍),活細(xì)胞內(nèi)實現(xiàn)了高的信噪比。同時,氮雜環(huán)丁烷取代基類似氮丙啶能有效抑制TICT,使
5、得BGAN-Aze結(jié)合SNAP-tag后獲得高的熒光強度和光穩(wěn)定性,實現(xiàn)了對目標(biāo)蛋白的超分辨(SIM/STED)免洗熒光成像。此外,BGAN-Amino能夠快速對SNAP-tag進行標(biāo)記,達到了熒光增強型SNAP-tag探針目前最快的標(biāo)記速度(t1/2=11s,k=14436±1189M-1s-1)。
(3)在4-酰胺基-1,8-萘酰亞胺體系中,發(fā)現(xiàn)了一種新型激發(fā)態(tài)質(zhì)子轉(zhuǎn)移(ESPT)機理的熒光響應(yīng)機制,并以此設(shè)計合成了一系列
6、比率型熒光探針(BuAN-AceN,SML-AceN),實現(xiàn)了基于微環(huán)境變化的蛋白比率熒光檢測。以BuAN-AceN為模型分子,發(fā)現(xiàn)其在水環(huán)境中為短波長熒光發(fā)射(~470nm),在非水環(huán)境中為長波長熒光發(fā)射(~550nm)。通過核磁、吸收光譜、熒光光譜、瞬態(tài)光譜及模型化合物對比等實驗手段,提出并驗證了這種環(huán)境變化引起的比率熒光響應(yīng)是由一種新型的ESPT機理導(dǎo)致的?;邗0放c脂肪胺間質(zhì)子轉(zhuǎn)移機制,以苯磺胺為碳酸酐酶(hCA)識別基團,設(shè)計
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