新布尼亞病毒傳播媒介、宿主和蜱傳疾病的人群血清流行病學(xué)研究.pdf

1、發(fā)熱伴血小板減少綜合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS)是新發(fā)的一種自然疫源性疾病，2009年首次在中國(guó)被發(fā)現(xiàn)。這種疾病是由一種新發(fā)現(xiàn)的布尼亞病毒引起的。2010年，本人的博士指導(dǎo)教師于學(xué)杰教授將其分離出來并命名為發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(severe fever withthrombocytopenia syndrome virus，SFTSV)，簡(jiǎn)稱為發(fā)熱伴病毒或新

2、布尼亞病毒，其屬于布尼亞病毒科白蛉病毒屬，是一種分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒，基因組包括:L、M和S三個(gè)片段。
　　SFTS的病例主要分布于中國(guó)中東部的山區(qū)、丘陵地帶。該病的高發(fā)季節(jié)主要集中在每年的四到九月，但發(fā)病時(shí)間亦存在地域性差異。該病主要發(fā)病人群是50歲以上的農(nóng)民，其病死率約為12％～30％。該病以發(fā)熱、白細(xì)胞減少、血小板降低為主要癥狀，并伴有全身不適、乏力、頭痛、肌肉酸痛以及惡心和嘔吐等臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重者出現(xiàn)多器官衰竭致死。病

3、例大部分呈零星的散在分布，也有個(gè)別的聚集性病例。已證實(shí)，SFTSV可以通過接觸病人血液和分泌物感染，存在人與人間的傳播。
　　發(fā)現(xiàn)至今，關(guān)于SFTS的病原、流行特征、臨床診斷和治療的研究均取得一定進(jìn)展。但SFTSV的傳播循環(huán)模式尚無明確的定論，目前僅局限于對(duì)流行區(qū)的家畜、嚙齒類動(dòng)物和媒介節(jié)肢動(dòng)物的流行病學(xué)調(diào)查研究。許多的研究報(bào)道，在硬蜱屬的長(zhǎng)角血蜱、微小牛蜱、龜形花蜱中檢測(cè)到SFTSV。因長(zhǎng)角血蜱是中國(guó)的優(yōu)勢(shì)蜱種，推測(cè)長(zhǎng)角血蜱可能

4、是中國(guó)地區(qū)SFTSV的主要傳播媒介和潛在宿主。
　　近年來，各種新發(fā)和再發(fā)的蜱傳疾病對(duì)公共衛(wèi)生安全以及畜牧業(yè)的健康發(fā)展造成很大威脅。為此，本課題主要研究長(zhǎng)角血蜱在SFTSV傳播循環(huán)模式中的作用，同時(shí)對(duì)蜱攜帶的其它病原微生物如無形體和埃立克體進(jìn)行檢測(cè)以及蜱傳疾病的人群流行病學(xué)研究，預(yù)測(cè)相關(guān)病原的潛在致病性，為預(yù)防和控制蜱傳疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論指導(dǎo)。
　　目的：
　　1.蜱作為SFTSV的宿主研究
　　1.1.檢測(cè)

5、草地未吸血長(zhǎng)角血蜱的三個(gè)不同生活周期SFTSV的感染率，分析長(zhǎng)角血蜱在SFTS傳播中的作用。
　　1.2.建立實(shí)驗(yàn)室SFTSV感染動(dòng)物模型，探討SFTSV在長(zhǎng)角血蜱中的傳播循環(huán)模式。
　　2.SFTSV的核蛋白(NP)的原核表達(dá)
　　擬對(duì)SFTSV的核蛋白(NP)的全序列進(jìn)行原核表達(dá)，獲取高效表達(dá)的重組目的蛋白，用于后續(xù)的健康人群的SFTSV抗體檢測(cè)。
　　3.長(zhǎng)角血蜱攜帶無形體和埃立克體的檢測(cè)
　　檢測(cè)草

6、地上長(zhǎng)角血蜱無形體和埃立克體的攜帶率，分析無形體和埃立克體的感染對(duì)公共衛(wèi)生造成的潛在危害。
　　4.健康人群蜱傳疾病的流行病學(xué)調(diào)查
　　分析蓬萊市健康人群蜱傳疾病(SFTSV、無形體)的抗體水平情況，掌握其抗體動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)，以期進(jìn)一步提高對(duì)該類疾病的認(rèn)識(shí)，為疫情控制提供流行病學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　　1.2013.5～2013.7和2015.5分別在山東膠南和浙江岱山運(yùn)用布旗法采集野外草地游離未吸血蜱。
　

7、　2.運(yùn)用RT-PCR和PCR對(duì)草地上長(zhǎng)角血蜱攜帶的病原體進(jìn)行檢測(cè)，擴(kuò)增的陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行克隆轉(zhuǎn)化測(cè)序，并用Clustal X2.1、MegaAlign、Mega6.0軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行核苷酸、核苷酸序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析。
　　3.運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR監(jiān)測(cè)染毒昆明小鼠一周內(nèi)SFTSV病毒載量的變化趨勢(shì)。
　　4.運(yùn)用空斑形成單位法檢測(cè)培養(yǎng)收獲的病毒滴度。
　　5.采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)和間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)

8、(IFA)檢測(cè)染毒昆明小鼠SFTSV抗體水平。
　　6.運(yùn)用PCR法擴(kuò)增SFTSV NP基因，并克隆至pET32a載體，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET32a-NP，經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定后轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21(DE3)，再經(jīng)誘導(dǎo)、純化得到pET32a-NP融合蛋白，采用Western Blot驗(yàn)證融合蛋白pET32a-NP的抗原性。
　　7.2015.11～2016.1在山東省蓬萊市小門家、大柳行、大辛店三個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)六個(gè)行政村運(yùn)用多階段單純隨機(jī)

9、抽樣抽樣方法，采集健康人群血清628份，采用ELISA檢測(cè)健康人群血清中無形體和SFTSV抗體。
　　結(jié)果：
　　1.長(zhǎng)角血蜱作為新布尼亞病毒的傳播媒介、宿主的研究結(jié)果
　　1.1.蟀標(biāo)本SFTSV檢測(cè)結(jié)果
　　本課題組在山東膠南草地共采集蜱3,300只，其中幼蜱120只，稚蜱1,620只，成蜱1,560只。經(jīng)過形態(tài)學(xué)鑒定和16S rRNA基因分子生物學(xué)鑒定，草地上采集到的蜱標(biāo)本主要是長(zhǎng)角血蜱。本次研究山東膠南草

10、地上長(zhǎng)角血蜱共有8管SFTSV陽(yáng)性，以最小感染率計(jì)算長(zhǎng)角血蜱SFTSV的總感染率為0.2％，幼蜱、稚蜱、成蜱的SFTSV感染率分別為0(0/120)、0.12％(2/1,620)，0.39％(6/1,560)。這一研究表明未吸血長(zhǎng)角血蜱可以攜帶SFTSV。
　　1.2.不同時(shí)期長(zhǎng)角血蜱叮咬染毒小鼠后，長(zhǎng)角血蜱SFTSV的感染情況
　　正常幼蜱叮咬染毒小鼠，運(yùn)用RT-PCR檢測(cè)飽血后長(zhǎng)角血蜱SFTSV的陽(yáng)性率為18％(9/50

11、)，蛻皮進(jìn)化成稚蜱SFTSV的陽(yáng)性率為11.7％(14/120)。正常稚蜱叮咬染毒小鼠，運(yùn)用RT-PCR檢測(cè)飽血后長(zhǎng)角血蜱稚蜱SFTSV的陽(yáng)性率為20％(2/10)，蛻皮進(jìn)化成成蜱時(shí)SFTSV的陽(yáng)性率為11.7％(14/120)。13只正常成蜱叮咬染毒小鼠，運(yùn)用RT-PCR檢測(cè)飽血后成蜱SFTSV的陽(yáng)性率為46.2％(6/13)，產(chǎn)卵孵化成幼蜱時(shí)SFTSV的陽(yáng)性率為53.8％(7/13)。這一研究，表明蜱能經(jīng)卵和經(jīng)期傳播SFTSV，蜱是

12、SFTSV的自然宿主。
　　1.3.不同時(shí)期染毒長(zhǎng)角血蜱叮咬正常小鼠后，小鼠SFTSV的感染情況
　　染毒稚蜱叮咬正常小鼠后，小鼠SFTSV的感染率為40％(4/10);染毒成蜱叮咬正常小鼠，小鼠SFTSV的感染率為20％(2/10)，RT-PCR結(jié)果與小鼠SFTSV抗體結(jié)果一致。這一研究表明，蜱可以從感染動(dòng)物獲得SFTSV并能傳播SFTSV給動(dòng)物，說明蜱是SFTSV的傳播媒介。
　　2.草地游離蜱攜帶埃立克體和無形體

13、檢測(cè)結(jié)果
　　2.1.蜱標(biāo)本埃立克體和無形體的檢測(cè)結(jié)果
　　浙江岱山草地共采集蜱標(biāo)本780只，其中幼蜱0只，稚蜱630只，成蜱150只。用埃立克體的16SrRNA、gltA和groEL基因特異性引物進(jìn)行巢氏PCR檢測(cè)，以最小感染率計(jì)算浙江岱山長(zhǎng)角血蜱埃立克體的感染率為0.4％(3/780)，3管均為稚蜱。山東的蜱標(biāo)本中未檢測(cè)出埃立克體。DNA序列分析顯示，來自長(zhǎng)角血蜱中的埃立克體與Ehrlichia種屬的16S rRNA同源

14、性為98.3％～99.8％，與E.ewingii的同源性最高。核苷酸序列同源性分析顯示groEL和gltA基因的同源性分別為89.6％～93.8％和68.5％～90.4％，與E.ewingii是在一個(gè)分支上。
　　隨機(jī)抽取山東膠南蜱標(biāo)本1,680只，其中幼蜱120只，稚蜱1,200只，成蜱360只。用無形體16S rRNA基因特異性引物進(jìn)行巢氏PCR檢測(cè)，以最小感染率計(jì)算山東膠南長(zhǎng)角血蜱無形體的感染率為0.18(3/1,680)，

15、其中兩管稚蜱，一管成蜱，無形體的感染率分別為0.17％(2/1,200)和0.28％(1/360)。浙江岱山的蜱標(biāo)本中未檢測(cè)出無形體。核苷酸序列同源性分析顯示來自山東長(zhǎng)角血蜱中的16SrRNA與無形體種屬的同源性為99.0％～99.5％。
　　3.蜱傳疾病的人群血清流行病學(xué)研究
　　3.1.成功構(gòu)建了pET32a-NP融合蛋白原核表達(dá)載體
　　0.5 mM IPTG，誘導(dǎo)10h，重組目的蛋白pET32a-NP在BL21

16、細(xì)菌中獲得高效表達(dá)。電泳分析表明目的蛋白以包涵體表達(dá)為主，純化后的pET32a-NP融合蛋白具有良好的抗原性。將純化復(fù)性后的pET32a-NP融合蛋白作為抗原包被ELISA板，每孔300ng，用于后續(xù)健康人群SFTSV抗體檢測(cè)。
　　3.2.蓬萊市健康人群血清流行病學(xué)研究
　　3.2.1.SFTSV總陽(yáng)性率
　　共檢測(cè)血清標(biāo)本628份，其中無形體陽(yáng)性血清22份，陽(yáng)性率為3.5％(22/628);SFTSV陽(yáng)性血清33份

17、，陽(yáng)性率為5.25％(33/628)。
　　3.2.2.無形體抗體檢出情況
　　三個(gè)不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)正常人群無形體抗體陽(yáng)性率分別為2.84％(6/211)，3.85％(8/208)和3.83％(8/209)。其中，男性無形體抗體陽(yáng)性率為3.45％(11/319)，女性無形體抗體陽(yáng)性率為3.56％(11/309);青壯年、中年、老年三個(gè)不同年齡組無形體抗體陽(yáng)性率分別為4.73％(10/211)、4.12％(11/267)和0.67％(

18、1/150)。農(nóng)民、工人及其他無形體抗體陽(yáng)性率分別為4.37％(20/458)，1.32％(1/76)，1.06％(1/94)。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)、性別、職業(yè)之間無形體抗體陽(yáng)性率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.1)。不同年齡之間無形體抗體陽(yáng)性率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.1)。
　　3.2.3.SFTSV抗體檢出情況
　　三個(gè)不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)正常人群SFTS抗體陽(yáng)性率分別為5.69％(12/211)，5.29％(11/208)和4.78％(10

19、/209)。青壯年、中年、老年三個(gè)不同年齡組SFTS抗體陽(yáng)性率分別為3.32％(7/211)，7.49％(20/267)和4％(6/150)。男性SFTS抗體陽(yáng)性率為4.39％(14/319)，女性SFTS抗體陽(yáng)性率為6.15％(19/309)。農(nóng)民、工人及其他人SFTS抗體陽(yáng)性率為6.55％(30/458)，1.32％(1/76)，2.13％(2/94)。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)、性別之間SFTS抗體陽(yáng)性率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.1)。不

20、同年齡、職業(yè)人群SFTS抗體陽(yáng)性率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.1)。
　　結(jié)論及意義：
　　1.草地未吸血長(zhǎng)角血蜱可攜帶SFTSV、無形體和埃立克體，說明長(zhǎng)角血蜱是這些病原菌的和病毒的自然宿主。
　　2.不同時(shí)期的長(zhǎng)角血蜱叮咬染毒小鼠后，運(yùn)用RT-PCR檢測(cè)飽血和蛻皮后的長(zhǎng)角血蜱SFTSV的陽(yáng)性率，證實(shí)SFTSV在長(zhǎng)角血蜱體內(nèi)能經(jīng)期傳播;成蜱叮咬染毒小鼠后，運(yùn)用RT-PCR檢測(cè)飽血的成蜱陽(yáng)性，產(chǎn)卵后幼蜱陽(yáng)性，證實(shí)SFTSV在

21、長(zhǎng)角血蜱體內(nèi)存在經(jīng)卵傳播。這一試驗(yàn)證明長(zhǎng)角血蜱是SFTSV的儲(chǔ)存宿主。
　　3.RT-PCR檢測(cè)證明長(zhǎng)角血蜱能夠從染毒小鼠獲得SFTSV,也能將SFTSV傳播給小鼠，證明蜱是SFTSV的傳播媒介。
　　4.蓬萊市健康人群中SFTSV和無形體抗體陽(yáng)性率較高，提示蓬萊市存在SFTSV和無形體的流行及隱性感染。不同職業(yè)的人群的感染率不同，這主要是因?yàn)椴煌巳号c蜱接觸機(jī)會(huì)不同，我們需加強(qiáng)易感人群對(duì)無形體和SFTSV感染的的預(yù)防意識(shí)，