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文檔簡介
1、累托石(Rectorite,REC)是一種規(guī)則層狀硅酸鹽粘土礦物,已被研究用于食品和醫(yī)療等領域,但其毒性方面的探討仍舊缺乏。紫杉醇(Paclitaxel,PTX)作為一種有效的抗腫瘤藥物,在實際的臨床應用中仍然存在許多不足之處。在此,我們主要討論了REC有機改性前后細胞毒性作用大小的改變及相關毒性作用的機制,以及REC對紫杉醇納米纖維素膜藥物傳遞系統(tǒng)抑癌活性的影響。
本研究主要由以下兩部分組成:
第一部分鈣基累托石納
2、米顆粒有機改性前后的細胞毒性的研究
目的:在本研究中,我們通過分析REC有機改性前后理化性質的改變,及其對于人張氏肝細胞及人肝癌細胞HepG2的毒性作用及相關機制,為REC及有機累托石(Organic modified rectorite,OREC)在未來應用中的安全性提供實驗依據(jù)。
方法:用REC與十六烷基三甲基溴化銨陽離子交換制備OREC并測定REC及OREC的粒徑大小和ζ電位;用熱重曲線分析兩者的熱穩(wěn)定性;用傅
3、里葉變換紅外光譜、透射電鏡和小角X射線衍射評價REC及OREC的層間距大小及化學組成;用能量色散X射線光譜判斷人張氏肝細胞中REC及OREC的攝入;濃度為0、1、2.5、5、7.5和10μg/mL的REC或OREC分別處理人張氏肝細胞和HepG2細胞6、24及48 h后,采用MMT法檢測其細胞毒性;濃度為0、1、2.5、5、7.5和10μg/mL的REC或OREC處理人張氏肝細胞24 h后,用流式細胞術分析細胞的凋亡和壞死;0、1、2.
4、5、5、7.5和10μg/mL REC或OREC處理人張氏肝細胞6 h或24 h后,檢測凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2和pro-caspase-3的表達。5μg/mL的REC或OREC處理HepG2細胞24后,掃描電鏡下觀察自噬小體并檢測自噬相關蛋白的表達。
結果:REC在有機改性后,層間距增加。REC及 OREC處理人張氏肝細胞24 h后,納米顆粒被攝入細胞內。1、2.5、5、7.5及10μg/mL的REC或OREC處理人張
5、氏肝細胞和HepG2細胞6、24和48 h后,均能觀察到細胞活性下降(P<0.05 or P<0.01),且OREC所致的細胞毒性較REC大,兩種細胞間毒性作用沒有差異。7.5和10μg/mL的REC或OREC處理24 h后,人張氏肝細胞的凋亡壞死率均有提高(P<0.05 or P<0.01)。5、7.5、10μg/mL的REC或OREC處理人張氏肝細胞24 h后,Bax、Bcl-2及pro-Caspase-3的表達均有所下降,但Bax
6、/Bcl-2比值沒有變化,提示并非通過 Bax相關線粒體凋亡通路誘導細胞凋亡。5μg/mL的REC或OREC處理HepG2細胞24 h后,均能在細胞內觀察到自噬小體,且LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增大,提示自噬的發(fā)生。
結論:研究結果表明,有機改性后,REC的理化特性在各方面均有較大的提升,但其細胞毒性也有明顯的增加。REC及OREC通過細胞凋亡以及細胞自噬共同誘導細胞的死亡。在實現(xiàn)OREC在食品和醫(yī)療等領域的應用時應注意其生物
7、安全性。
第二部分累托石對紫杉醇納米纖維素膜體外抑癌活性影響的研究
目的:我們以醋酸纖維素(Cellulose acetate,CA)作為輔料,采用靜電紡絲法制作紫杉醇醋酸納米纖維素膜(CA/PTX0.06及 CA/PTX0.12)及加入累托石(Rectorite,REC)的紫杉醇醋酸納米纖維素膜(CA/PTX0.06/REC及CA/PTX0.12/REC),并研究REC對納米纖維理化性質、體外PTX藥物釋放行為以及
8、對人胃細胞毒性的影響。
方法:納米纖維素膜形貌,選用場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察;布魯諾爾-埃米特-特勒比表面積,選用氮吸附法測定;復合納米纖維素膜的組成成分,由能量色散X射線測定;膜中PTX、CA、REC的相互作用,由傅里葉變換紅外光譜和廣角X射線衍射研究;熱穩(wěn)定性由差示掃描量熱法以及熱重分析確定;復合納米纖維素膜中PTX在pH值為7.4的磷酸鹽緩沖鹽水的釋放行為,用高效液相色譜測定;人胃癌細胞SGC7901,以及人胃上皮細胞G
9、ES-1在納米纖維素膜上生長24 h后,細胞毒性由LIVE/DEAD細胞活性/細胞毒性試劑盒測定,細胞超微結構通過掃描電鏡觀察。
結果: REC和PTX均被成功紡入復合納米纖維素膜。并且CA的熱穩(wěn)定性未受到影響。所有復合納米纖維素膜的纖維表面光滑,各樣本纖維間的形貌沒有明顯差別,在加入REC后比表面積有所增加。膜上種植細胞前后,所有的膜樣品均表現(xiàn)出典型的3D電紡納米纖維形貌。CA/PTX和CA/PTX/REC膜中PTX的釋放行
10、為保持相對穩(wěn)定緩慢,并且REC提高了藥物的釋放率。CA/PTX和CA/PTX/REC對SGC7901和GES-1細胞均有毒性,兩種細胞系的毒性作用沒有顯著區(qū)別,且CA/PTX/REC毒性均較CA/PTX大。所有的膜都能為GES-1和SGC7901細胞的附著和延伸提供良好的支架。
結論:CA及CA/REC均具有較高的細胞親和力,CA/PTX及CA/PTX/REC釋放PTX穩(wěn)定,且表現(xiàn)出一定的細胞致死能力。REC通過提高PTX的累
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