天麻miRNA的鑒定與分析及其跨界調控初探.pdf

1、天麻是中國一種名貴的中藥材，具有抗驚厥作用，神經保護，抗炎以及免疫調節(jié)等多種功能。目前，關于天麻的研究主要集中于對天麻的粗提物或者天然化學成分的藥理研究以及產品開發(fā)，還未有任何關于天麻中microRNA的報道。microRNA（miRNA）是一類長19-24nt非編碼的小RNA分子，廣泛地參與了人類疾病的代謝過程。它能夠通過與靶mRNA結合，從而降解靶mRNA或者抑制其翻譯。miRNA通過對多種信號通路上的關鍵的因子進行調控，從而影響細

2、胞的增殖、分化和衰老等過程。本項目系統(tǒng)的鑒定和分析了天麻小RNA，并從跨界的角度探討天麻miRNA在炎癥發(fā)生過程中的作用，為揭示天麻抗炎免疫的分子作用機制奠定基礎，同時為miRNA的跨界調控提供新的證據。
　　首先，利用Illumina高通量測序分析技術對天麻小RNA（sRNA）進行了測序，得到了大量的天麻sRNA。在箭麻和禾麻的花莖芽與塊莖四個組織中分別得到了9，798，753個、10，713，576個、11，916，192個和

3、11，229，380個測序read。經過去低質量、去接頭和去污染后，得到了9，666，044個、10，508，310個、11，763，094個和11，074，999個Clean reads數。再對clean序列進行了長度分布統(tǒng)計。統(tǒng)計結果顯示miRNA和siRNA相對較多，推測其可能對于調節(jié)基因表達起重要作用。結果發(fā)現(xiàn)了5718個天麻miRNA，其中天麻特有的全新miRNA共有52個。挑選10個候選miRNA(Gas-miR159，Ga

4、s-miR6478，Gas-miR148a-3p，Gas-miR99，Gas-miR143-3p,Gas-miR319f,Gas-miR396e,Gas-miR26a,Gas-miR01和Gas-miR02)，利用qRT-PCR進行進一步的驗證。10個候選miRNA在不同天麻組織中的相對表達水平與高通量測序結果基本一致。
　　其次，利用qRT-PCR檢測了上述10個miRNA在天麻種子、米麻、白麻、箭麻幾個時期的相對表達水平。結果

5、顯示，Gas-miR319f在種子、米麻和白麻時期表達量相差不大，但是到了箭麻時期Gas-miR319f會急劇升高到原來的20倍。對其中表達量較高且穩(wěn)定的天麻特有的Gas-miR01和Gas-miR02利用TargetScan和RNAhybrid軟件預測其在人類基因組中的靶基因，并進行KEGG分析，結果發(fā)現(xiàn)Gas-miR01和Gas-miR02均能靶向NF-κB信號通路上三個關鍵的炎癥發(fā)生相關基因A20、TNF-α和IκBα，提示該天麻

6、中特有的兩個miRNA分子有可能作為一種重要的小RNA分子，跨界調控NF-κB信號通路上的關鍵基因，進而參與人類機體免疫和炎癥反應等生理過程。
　　進一步利用qRT-PCR檢測分別灌胃天麻片煎煮液、天麻粉和天麻總RNA的實驗小鼠各個組織中的Gas-miR01和Gas-miR02水平。結果表明，實驗組小鼠的各個組織中，天麻miRNA Gas-miR01和Gas-miR02的含量均明顯高于對照組，證實Gas-miR01和Gas-miR

7、02的確能夠通過胃腸道進入到小鼠體內。上述結果為進一步研究天麻小RNA的跨界功效提供了基礎。
　　最后，將Gas-miR01mimics、Gas-miR02mimics和miRNA negative control分別轉染至293T細胞中。Western Blotting結果顯示，Gas-miR01mimics和Gas-miR02mimics均能夠下調NF-κβ信號通路上的關鍵蛋白A20。NF-κB被激活時，IKKβ磷酸化A20，