天麻miRNA的鑒定與分析及其跨界調(diào)控初探.pdf

1、天麻是中國(guó)一種名貴的中藥材，具有抗驚厥作用，神經(jīng)保護(hù)，抗炎以及免疫調(diào)節(jié)等多種功能。目前，關(guān)于天麻的研究主要集中于對(duì)天麻的粗提物或者天然化學(xué)成分的藥理研究以及產(chǎn)品開(kāi)發(fā)，還未有任何關(guān)于天麻中microRNA的報(bào)道。microRNA（miRNA）是一類長(zhǎng)19-24nt非編碼的小RNA分子，廣泛地參與了人類疾病的代謝過(guò)程。它能夠通過(guò)與靶mRNA結(jié)合，從而降解靶mRNA或者抑制其翻譯。miRNA通過(guò)對(duì)多種信號(hào)通路上的關(guān)鍵的因子進(jìn)行調(diào)控，從而影響細(xì)

2、胞的增殖、分化和衰老等過(guò)程。本項(xiàng)目系統(tǒng)的鑒定和分析了天麻小RNA，并從跨界的角度探討天麻miRNA在炎癥發(fā)生過(guò)程中的作用，為揭示天麻抗炎免疫的分子作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為miRNA的跨界調(diào)控提供新的證據(jù)。
　　首先，利用Illumina高通量測(cè)序分析技術(shù)對(duì)天麻小RNA（sRNA）進(jìn)行了測(cè)序，得到了大量的天麻sRNA。在箭麻和禾麻的花莖芽與塊莖四個(gè)組織中分別得到了9，798，753個(gè)、10，713，576個(gè)、11，916，192個(gè)和

3、11，229，380個(gè)測(cè)序read。經(jīng)過(guò)去低質(zhì)量、去接頭和去污染后，得到了9，666，044個(gè)、10，508，310個(gè)、11，763，094個(gè)和11，074，999個(gè)Clean reads數(shù)。再對(duì)clean序列進(jìn)行了長(zhǎng)度分布統(tǒng)計(jì)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示miRNA和siRNA相對(duì)較多，推測(cè)其可能對(duì)于調(diào)節(jié)基因表達(dá)起重要作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了5718個(gè)天麻miRNA，其中天麻特有的全新miRNA共有52個(gè)。挑選10個(gè)候選miRNA(Gas-miR159，Ga

4、s-miR6478，Gas-miR148a-3p，Gas-miR99，Gas-miR143-3p,Gas-miR319f,Gas-miR396e,Gas-miR26a,Gas-miR01和Gas-miR02)，利用qRT-PCR進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。10個(gè)候選miRNA在不同天麻組織中的相對(duì)表達(dá)水平與高通量測(cè)序結(jié)果基本一致。
　　其次，利用qRT-PCR檢測(cè)了上述10個(gè)miRNA在天麻種子、米麻、白麻、箭麻幾個(gè)時(shí)期的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果

5、顯示，Gas-miR319f在種子、米麻和白麻時(shí)期表達(dá)量相差不大，但是到了箭麻時(shí)期Gas-miR319f會(huì)急劇升高到原來(lái)的20倍。對(duì)其中表達(dá)量較高且穩(wěn)定的天麻特有的Gas-miR01和Gas-miR02利用TargetScan和RNAhybrid軟件預(yù)測(cè)其在人類基因組中的靶基因，并進(jìn)行KEGG分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Gas-miR01和Gas-miR02均能靶向NF-κB信號(hào)通路上三個(gè)關(guān)鍵的炎癥發(fā)生相關(guān)基因A20、TNF-α和IκBα，提示該天麻

6、中特有的兩個(gè)miRNA分子有可能作為一種重要的小RNA分子，跨界調(diào)控NF-κB信號(hào)通路上的關(guān)鍵基因，進(jìn)而參與人類機(jī)體免疫和炎癥反應(yīng)等生理過(guò)程。
　　進(jìn)一步利用qRT-PCR檢測(cè)分別灌胃天麻片煎煮液、天麻粉和天麻總RNA的實(shí)驗(yàn)小鼠各個(gè)組織中的Gas-miR01和Gas-miR02水平。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組小鼠的各個(gè)組織中，天麻miRNA Gas-miR01和Gas-miR02的含量均明顯高于對(duì)照組，證實(shí)Gas-miR01和Gas-miR

7、02的確能夠通過(guò)胃腸道進(jìn)入到小鼠體內(nèi)。上述結(jié)果為進(jìn)一步研究天麻小RNA的跨界功效提供了基礎(chǔ)。
　　最后，將Gas-miR01mimics、Gas-miR02mimics和miRNA negative control分別轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中。Western Blotting結(jié)果顯示，Gas-miR01mimics和Gas-miR02mimics均能夠下調(diào)NF-κβ信號(hào)通路上的關(guān)鍵蛋白A20。NF-κB被激活時(shí)，IKKβ磷酸化A20，