微絲相關(guān)的三丁基錫毒性機(jī)理研究.pdf

1、三丁基錫（tributyltin，TBT）是一種重要的有機(jī)錫化合物，憑借其特有的理化性質(zhì)可用作木材防腐劑，船體涂料的防污劑，紡織業(yè)、工業(yè)水系統(tǒng)、木漿和造紙系統(tǒng)以及啤酒廠的抑菌劑等。隨著其長期而廣泛的大量使用，T B T及其降解副產(chǎn)物對人類及環(huán)境所造成的危害已越來越受到人們的重視。已有大量實(shí)驗(yàn)研究表明TBT可對人體及動物造成嚴(yán)重危害，主要包括神經(jīng)毒性、免疫毒性、生殖毒性以及肝毒性等。
　　肝臟是 TBT進(jìn)入人體后主要的代謝器官，TB

2、T在肝臟內(nèi)可降解成 DBT（二丁基錫）和MDT（一丁基錫），并可產(chǎn)生明顯的肝毒性。本研究選用人來源的正常肝細(xì)胞系 HL7702細(xì)胞作為研究對象，探討 TBT損傷肝細(xì)胞的分子機(jī)制。
　　細(xì)胞骨架在細(xì)胞的生命活動中發(fā)揮著十分重要的作用，例如推動細(xì)胞運(yùn)動、物質(zhì)運(yùn)輸、建立和維持細(xì)胞形態(tài)、參與細(xì)胞分裂和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能。作為細(xì)胞骨架的重要組成成分，微絲在此過程中起著舉足輕重的作用。本研究首先明確TBT對微絲網(wǎng)絡(luò)以及微絲相關(guān)蛋白表達(dá)和/或磷酸化

3、的影響，進(jìn)而探索 TBT破壞細(xì)胞骨架的信號通路，以期最終明確微絲相關(guān)的信號通路在 TBT誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷中的分子機(jī)制。
　　主要研究方法：
　　1. MTT法檢測細(xì)胞增殖活力，以0、2、4、6、8、10μM TBT處理細(xì)胞1、2、4h后，對細(xì)胞增殖情況進(jìn)行檢測，根據(jù)結(jié)果選取后續(xù)染毒時間為2h，濃度從上；
　　2.免疫熒光法檢測細(xì)胞微絲結(jié)構(gòu)，用熒光燃料標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽對細(xì)胞進(jìn)行染色后，在共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞微絲結(jié)構(gòu)并拍照；

4、
　　3. Western-Blot法檢測細(xì)胞微絲相關(guān)蛋白表達(dá)和/或磷酸化水平，以及 MAPK信號通路的激活狀態(tài)。
　　4. MAPK抑制試驗(yàn)，以JNK、ERK1/2、P38特異性抑制劑對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，再以10μM TBT處理細(xì)胞后，檢測其相關(guān)蛋白表達(dá)水平。
　　主要研究結(jié)果：
　　1. TBT暴露可影響 HL7702細(xì)胞的增殖。隨著 TBT染毒濃度的增加，細(xì)胞增殖呈先上升后下降的趨勢。
　　2. TBT

5、可造成HL7702細(xì)胞微絲解聚，形成點(diǎn)狀聚集物和致密束。
　　3. TBT暴露可導(dǎo)致 HL7702細(xì)胞中 VASP的表達(dá)水平下降，而不改變其他微絲相關(guān)蛋白（Arp2/3、Ezrin、Cofilin）的表達(dá)水平。并且 p-VASP（239）、p-VASP（157）在高濃度組表達(dá)量上調(diào)，而 p-Cofilin則在2、8、10μM組表達(dá)量均下降。
　　4. TBT暴露可激活 HL7702細(xì)胞中 MAPK信號通路。JNK、ERK1/

6、2及 P38的表達(dá)水平并沒有改變，但 P-JNK和P-ERK1/2在高濃度時表達(dá)水平明顯上升。
　　5. JNK抑制劑和ERK1/2抑制劑可改善TBT對HL7702細(xì)胞形態(tài)及微絲相關(guān)蛋白磷酸化水平的影響，而 P38抑制劑則無此作用。
　　主要結(jié)論：
　　1. TBT在低濃度（≤4μM）時促進(jìn) HL7702細(xì)胞增殖，在高濃度（≥8μM）時則抑制其增殖。
　　2. TBT可破壞 HL7702細(xì)胞微絲的結(jié)構(gòu)。