小麥感白粉病候選基因的克隆與功能鑒定.pdf

1、近年來(lái)，由小麥白粉病菌(Blurmeria graminisf.sp.tritici，Bgt)引起的小麥白粉病在全國(guó)發(fā)病面積廣泛，嚴(yán)重影響小麥產(chǎn)量和品質(zhì)，培育抗白粉病小麥品種并運(yùn)用到生產(chǎn)實(shí)際中顯得尤為重要。目前小麥抗白粉病的研究主要致力于發(fā)掘抗病基因和病程相關(guān)基因，而關(guān)于小麥感白粉病基因發(fā)掘和感病機(jī)制的報(bào)道卻很少。
　　感病基因就是病原菌誘發(fā)寄主感病的過(guò)程不可缺少的植物蛋白，包括負(fù)向調(diào)控抗病反應(yīng)的感病基因和利于病原菌生長(zhǎng)繁殖的感病

2、因子。感病基因突變引起的抗性往往具有持久性和廣譜性，如大麥mlo突變體抗大麥白粉菌幾乎所有的生理小種，該基因在生產(chǎn)上應(yīng)用已超過(guò)30年，其它物種中該基因突變也可以獲得白粉病廣譜抗性。本研究利用第二代測(cè)序技術(shù)對(duì)兩組抗/感近等基因系材料進(jìn)行高通量測(cè)序，發(fā)掘到14個(gè)僅在感白粉病材料中受白粉菌誘導(dǎo)后上調(diào)表達(dá)的感病候選基因，其中包括編碼血紅素結(jié)合蛋白的TaHBP基因、編碼具F-box保守結(jié)構(gòu)域的TaFBX基因和一個(gè)編碼腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的Ta

3、ABC基因。進(jìn)一步對(duì)這三個(gè)基因進(jìn)行了基因表達(dá)、進(jìn)化研究和基于RNAi技術(shù)的初步功能驗(yàn)證，研究結(jié)果表明這三個(gè)感病候選基因在小麥抗白粉病反應(yīng)中發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用。
　　1.利用第二代高通量測(cè)序技術(shù)篩選感白粉病候選基因
　　本研究對(duì)抗白粉病轉(zhuǎn)基因株系Tstpk-Ⅴ/感自粉病小麥?zhǔn)荏w揚(yáng)麥158和抗白粉病南農(nóng)9918/感白粉病突變體NM14兩組近等基因系材料進(jìn)行白粉菌誘導(dǎo)處理，提取非誘導(dǎo)、誘導(dǎo)24小時(shí)的RNA樣品，利用第二代測(cè)序技術(shù)進(jìn)行

4、基因表達(dá)譜測(cè)序，每個(gè)材料各獲得了超過(guò)13萬(wàn)條以上的distinct tag，其中能與小麥unigene數(shù)據(jù)匹配的特異標(biāo)簽各為2.6萬(wàn)-3.4萬(wàn)。對(duì)兩組抗感病材料的基因表達(dá)譜進(jìn)行分析，從中發(fā)掘出14個(gè)僅在兩個(gè)感病材料感白粉病小麥揚(yáng)麥158和感白粉病突變體NM14中受白粉菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)、而在2個(gè)抗病材料抗白粉病轉(zhuǎn)基因襪系Tstpk-Ⅴ和抗白粉病南農(nóng)9918中對(duì)白粉菌不應(yīng)答或者受白粉菌誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá)的基因，本研究將這14個(gè)基因列為感白粉病候選基

5、因(susceptibility candidate gene，SCG)。
　　2.感病相關(guān)基因的生物信息學(xué)分析
　　對(duì)14個(gè)感病基因中的三個(gè)具有推導(dǎo)功能的基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，這三個(gè)基因包括編碼血紅素結(jié)合蛋白的HBP基因TaHBP、編碼F-box蛋白的FBX基因TaFBX和一個(gè)編碼腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的ABC基因TaABC。TaHBP基因位于小麥染色體7A短臂上，編碼保守的血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域(SOUL/Heme-

6、binding protein)。TaFBX位于小麥染色體5A長(zhǎng)臂上，編碼一個(gè)Phloem protein蛋白結(jié)構(gòu)域，屬于PP2超家族。TaABC位子小麥第六同源群上，蛋白質(zhì)序列屬于植物的類PKc超家族。
　　3.感白粉病候選基因的表述特征分析
　　由于本研究使用的兩個(gè)抗病材料具有廣譜抗性，其中南農(nóng)9918含有Pm21基因，抗白粉病轉(zhuǎn)基因株系Tstpk-Ⅴ中的超量表達(dá)基因Stpk-Ⅴ是來(lái)自Pm21位點(diǎn)的關(guān)鍵基因，所以奉研究進(jìn)

7、一步分析了三個(gè)感白粉病候選基因在含有Pm21基因的材料中受白粉菌誘導(dǎo)表達(dá)的情況。選擇了3個(gè)不同生態(tài)區(qū)的含Pm21基因的抗病材料，包括石麥14（河北石家莊）、內(nèi)麥8號(hào)（四川內(nèi)江）和蘭天17（甘肅天水），利用QRT-PCR方法分析了感白粉病候選基因在這些材料受白粉菌誘導(dǎo)前后的表達(dá)情況。結(jié)果顯示:TaHBP在這些材料中受誘導(dǎo)24小時(shí)后的表達(dá)量明顯降低;TaFBX在石麥14和內(nèi)麥8號(hào)中的表達(dá)量下降，而在蘭天17中表達(dá)量幾乎沒(méi)有變化;TaABC受

8、白粉菌誘導(dǎo)后的表達(dá)量在三個(gè)材料中都出現(xiàn)了明顯的下降?；虮磉_(dá)分析結(jié)果表明TaHBP和TaABC在Pm21介導(dǎo)的抗病反應(yīng)中可能起負(fù)向調(diào)控的作用。
　　為了研究這三個(gè)基因在其他Pm基因抗性途徑中的表達(dá)模式，進(jìn)一步選擇了攜帶Pm2和Pm4a的抗白粉病小麥，利用QRT-PCR方法分析它們的表達(dá)情況。結(jié)果表明:TaHBP和TaABC在這兩個(gè)材料受白粉菌誘導(dǎo)24小時(shí)后都出現(xiàn)明顯的下調(diào)表達(dá);TaFBX在含Pm4a的抗白粉病小麥材料中，表達(dá)量明顯

9、降低，而在含Pm2的材料中，誘導(dǎo)后的表達(dá)量為誘導(dǎo)前表達(dá)量的80％，相比Pm4a下降幅度較小。TaHBP、TaFBX和TaABC在Pm2和Pm4a介導(dǎo)的白粉病抗病通路中可能也具有一定的灸向調(diào)控功能。
　　4.感白粉病候選基因的功能分析
　　為了研究TaHBP、TaFBX和TaABC三個(gè)基因在白粉病抗病途徑中的作用，本研究利用TIGS(transient induced gene silencing)瞬間表達(dá)技術(shù)和RNAi轉(zhuǎn)基因

10、技術(shù)，在單細(xì)胞水平和植株水平分別沉默三個(gè)基因，并通過(guò)葉片表皮單細(xì)胞吸器指數(shù)的統(tǒng)計(jì)和轉(zhuǎn)基因植株的抗病性鑒定，對(duì)三個(gè)基因進(jìn)行初步的功能分析。研究結(jié)果表明:揚(yáng)麥158葉片單細(xì)胞水平上沉默這三個(gè)基因都可使白粉菌的吸器指數(shù)下降，其中沉默TaHBP后吸器指數(shù)由51.1％降為40.2％，沉默TaFBX后吸器指數(shù)由51.8％降至43.8％，沉默TaABC后吸器指數(shù)由52.4％降至43.5％。
　　進(jìn)一步將三個(gè)基因的RNAi載體導(dǎo)入受體揚(yáng)麥158中

11、，創(chuàng)造基因沉默的轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)TaFBX的RNAi T0代植株進(jìn)行苗期離體鑒定，發(fā)現(xiàn)3棵抗性提高的植株，通過(guò)T1代苗期和成株期抗性鑒定發(fā)現(xiàn)，這三個(gè)株系出現(xiàn)抗感分離，PCR擴(kuò)增和基因表達(dá)分析結(jié)果顯示，TaFBX沉默的陽(yáng)性植株，抗性都得到了提高，說(shuō)明TaFBX參與到抗白粉病過(guò)程中，并且起負(fù)向調(diào)控的作用。在TaABC的RNAi T1代的鑒定中出現(xiàn)四個(gè)抗感分離的株系，這些株系對(duì)應(yīng)的T0代植株也有較高的抗病性，PCR鑒定結(jié)果顯示，成功導(dǎo)入RNAi

12、載體的T1代植株抗病性得到提高，說(shuō)明TaABC參與到抗白粉病途徑中，并且發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用。TaHBP的RNAi T0代植株有218株，對(duì)其中種植在田間的48棵轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了PCR鑒定獲得3棵陽(yáng)性植株，基因沉默植株的抗病性是否有變化有待用T1代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行抗病性鑒定。
　　綜上所述，選擇抗感材料近等基因系進(jìn)行高通量測(cè)序是篩選感病基因的一種可行手段，其遺傳背景的高度一致性可提高感病基因篩選效率;獲得感白粉病候選基因后，利用RN