小麥抗白粉病基因遺傳圖譜構(gòu)建及抗病相關(guān)基因的克隆.pdf

1、由禾布氏白粉菌小麥?；?Blumeria graminis(DC．)：E．O．Speer f.sp．tritici)引起的小麥白粉病，是世界范圍的重要小麥病害。利用抗病品種是防治該病最為經(jīng)濟(jì)、有效和環(huán)境安全的方法。與抗病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記不僅便于抗病基因鑒定和作圖，而且可以在育種中進(jìn)行抗病品種/系的標(biāo)記輔助選擇(MAS)分子標(biāo)記輔助選擇將極大地提高基因累加效率，加速育種進(jìn)程。植物抗病基因克隆的研究對(duì)于抗病育種和抗病機(jī)制的理解具有重

2、要意義。運(yùn)用抗病基因類似物法(RGA法)克隆分離目的基因或?qū)ふ倚碌目共』蚴且粭l最經(jīng)濟(jì)、快捷的途徑。 本研究對(duì)小麥抗白粉病基因載體品種/系進(jìn)行了抗性鑒定和遺傳分析。采用SSR、STS、SRAP和RGA等技術(shù)，鑒定了與小麥抗白粉病基因Pm4b緊密連鎖的分子標(biāo)記，并構(gòu)建了PmZB90基因的高密遺傳圖譜。同時(shí)運(yùn)用RGA方法克隆了一些抗病基因同源片段，進(jìn)一步做了RF-PCR分析和TAIL-PCR序列延伸，為獲得全長(zhǎng)抗病基因和研究小麥抗病

3、機(jī)理奠定基礎(chǔ)。 主要研究結(jié)果如下： 1．對(duì)小麥不同Pm基因載體品種/系的成株期抗性鑒定結(jié)果表明，29個(gè)己知單基因或多基因載體品種中，表現(xiàn)免疫的有6個(gè)，所攜帶基因?yàn)镻m4b、Pm13、Pm20、Pm21、Pm23和Pm24；表現(xiàn)高抗和中抗的基因有Pm4a、Pm6、Pm17、Pm22、Pm5a+6和Pm33。這些抗性好的基因應(yīng)該小麥抗病育種計(jì)劃中充分利用。 2．位于2A染色體長(zhǎng)臂上的小麥抗白粉病基因Pm4b是目前應(yīng)用

4、廣泛的有效抗病基因。本研究運(yùn)用集群分離分析法鑒定了四個(gè)與Pm4b基因連鎖的標(biāo)記。用240對(duì)引物組合篩選感抗池，有20對(duì)引物組合能在感抗池之間擴(kuò)增出多態(tài)性。進(jìn)一步用157株F<,2>分離群體驗(yàn)證標(biāo)記的連鎖性，最終獲得了兩個(gè)擴(kuò)增帶型穩(wěn)定，與Pm4b基因遺傳距離較近的標(biāo)記Me8/Em7-220和Me12/Em7-205。STS標(biāo)記STS-241距Pm4b基因僅4.9cM。另外，還分析了位于2A染色體長(zhǎng)臂的8個(gè)SSR標(biāo)記，題wm382與Pm4b

5、基因顯性分離，距Pm4b基因11.8cM。 分析這四個(gè)標(biāo)記對(duì)Pm4b基因的專一性，發(fā)現(xiàn)Xgwm382-125bp對(duì)Pm4基因位點(diǎn)特異。顯性標(biāo)記STS-241和Me8/Em7-220能夠區(qū)分Pm4b和Pm4a，可以被應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助選擇，有助于Pm4b基因的高效利用。為抗病基因的快速、有效和合理利用奠定基礎(chǔ)。 3．小麥農(nóng)家品種ZB90是一個(gè)有效的廣譜抗白粉病材料。苗期和成株期抗性鑒定表明，其白粉病抗性由顯性單基因控制，暫

6、命名為PmZB90。從位于不同染色體上的53個(gè)SSR標(biāo)記中篩選出3個(gè)標(biāo)記Xgwm311、Xgwm382和Xgwm312，對(duì)144株F<,2>分離群體進(jìn)行連鎖性分析。根據(jù)遺傳距離將PmZB90定位到小麥染色體2A長(zhǎng)臂。結(jié)合我們鑒定的STS標(biāo)記STS-470、RGA標(biāo)記RGA-1102、SRAP標(biāo)記Me5/Em5-650和Me8/Em16-600構(gòu)建了PmZB90基因的高密遺傳圖譜。PmZB90位點(diǎn)與7個(gè)標(biāo)記的順序?yàn)椋篗e5/Em5-650

7、-RGA-1102-PmZB90-Xgwm382-Xgwm311-Me8/Em16-600-STS-470-Xgwm312。這7個(gè)區(qū)間的遺傳距離依次為：3.7cM、9.2cM、2.9cM、4.5cM、2.3cM、20.8cM、49.6eM。與小麥染色體2AL上已構(gòu)建的遺傳圖譜順序一致。 根據(jù)材料來源、抗病基因的染色體定位結(jié)果及PmZB90同其他位于2AL上的基因之間的關(guān)系分析，確認(rèn)該基因?yàn)橐粋€(gè)新的小麥抗白粉病基因，可能同PmDR

8、147基因等位。小麥抗白粉病新基因PmZB90的鑒定和高密遺傳圖譜構(gòu)建，能夠彌補(bǔ)現(xiàn)有抗源材料的不足，為小麥抗白粉病育種提供新的優(yōu)良抗病基因。 4．本研究根據(jù)抗病基因保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并性引物，對(duì)小麥抗白粉病基因的一些載體品種/系進(jìn)行擴(kuò)增。從小麥VPM和ZB90中克隆了一些RGA片段，對(duì)其進(jìn)行序列分析和功能預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)有6個(gè)DNA片段屬于抗病基因同源序列，并著重分析了從小麥VPM中克隆的RGA1231和從ZB90中克隆的RGA1102

9、片段。 運(yùn)用RT-PCR技術(shù)：研究了小麥白粉菌誘導(dǎo)后Rc955基因的表達(dá)。Rc955受白粉菌的誘導(dǎo)，在一定時(shí)間內(nèi)表達(dá)量會(huì)有所增加，但變化不大，可能為組成型表達(dá)。 根據(jù)RGA序列RGA1102在兩端設(shè)計(jì)了3對(duì)嵌套式特異引物，利用TAIL-PCR技術(shù)將RGA1102成功向5’端延伸799bp，向3’端延伸281bp，序列延伸后的總長(zhǎng)度為2182bp。序列分析表明所獲得的序列包含一個(gè)全長(zhǎng)的編碼序列。以上研究為PmZB90基因的