基于高通量測(cè)序的Klebsiella pneumoniae基因組拼接的研究.pdf

1、克雷伯氏肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）是一種革蘭氏陰性細(xì)菌，目前主要用于生產(chǎn)2，3-丁二醇和1，3-丙二醇等化學(xué)品，同時(shí)可以代謝合成3-羥基丙醛、乙醇、乙酸、乳酸等。Klebsiella pneumoniae具有廣闊的工業(yè)化應(yīng)用前景。因此得到Klebsiella pneumoniae的全基因組序列，對(duì)其代謝途徑進(jìn)行研究及分子改造具有重要的意義。
　　 近幾年來，新一代高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)展迅速，已經(jīng)逐漸成為研

2、究基因組的重要手段。但是由于其Reads短、精度低和數(shù)據(jù)量大等缺點(diǎn)也為它用于生物學(xué)的研究帶來了不便。因此，如何從高通量測(cè)序數(shù)據(jù)中篩選出有價(jià)值的信息是生物信息學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。本文利用目前高通量測(cè)序技術(shù)中廣泛使用的Illumina/Solexa測(cè)序技術(shù)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室分離到的一株Klebsiella pneumoniae KG2進(jìn)行全基因組測(cè)序，以此建立工作平臺(tái)開展對(duì)測(cè)序后數(shù)據(jù)的拼接和分析研究，探究高通量測(cè)序數(shù)據(jù)處理的規(guī)律性。進(jìn)而獲得Klebs

3、iella pneumoniae的全基因組序列。
　　 本實(shí)驗(yàn)取得以下幾個(gè)主要結(jié)果:
　　 1、本實(shí)驗(yàn)針對(duì)抽提基因組DNA不純，有質(zhì)粒DNA污染的問題，提出了先去除質(zhì)粒再測(cè)序的設(shè)想，嘗試了采用高溫和消除劑消除質(zhì)粒的方法。結(jié)果表明Klebsiella pneumoniae的最佳質(zhì)粒消除條件為:采用培養(yǎng)溫度45℃，消除劑SDS濃度為0.3％復(fù)合條件，質(zhì)粒消除率可達(dá)41.7％。最終篩選到了消除質(zhì)粒的衍生菌株，為下一步測(cè)序及拼接

4、等提供了適宜的材料。
　　 2、本實(shí)驗(yàn)選擇了目前比較常用的三種拼接軟件Velvet、AbySS、SOAPdenovo對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接比較，并對(duì)同一軟件的不同拼接參數(shù)進(jìn)行拼接優(yōu)化分析，以期尋找最適的拼接軟件和最適拼接參數(shù)，為以后的研究提供參考借鑒。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Klebsiella pneumoniae基因組的最適拼接軟件為Velvet，最適拼接參數(shù)K-mer為27。
　　 3、基于目前大多數(shù)軟件都是從頭拼接，對(duì)于如何進(jìn)

5、一步拼接contigs仍然是個(gè)問題。本實(shí)驗(yàn)提出了利用參考基因組指導(dǎo)拼接的新思路。研究了利用參考基因組序列將contigs進(jìn)行重排形成scaffold，然后根據(jù)重疊序列進(jìn)行拼接的新方法，最終得到了最佳的scaffold(number=104，N50=98160bp)。該方法為序列拼接的研究提供了新手段。
　　 4、為了找到與目的菌最相似的參考基因組，提高參考基因組重排contigs的準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)通過NCBI在線BLAST搜索，構(gòu)

6、建16SrDNA進(jìn)化樹和比較Mapping率，找到了最佳的參考基因組Klebsiella pneumoniae KCTC2242。
　　 經(jīng)過研究本實(shí)驗(yàn)得到了絕大部分的Klebsiella pneumoniae菌株KG2的基因組序列，為后續(xù)對(duì)及代謝途徑的研究和分子改造奠定了基礎(chǔ)。
　　 在DNA測(cè)序手段還沒有突破性進(jìn)展的前提下，全基因組序列拼接仍然是生物信息學(xué)領(lǐng)域重要的研究?jī)?nèi)容，本文對(duì)全基因組的序列拼接軟件做了詳細(xì)的分析