幾種病毒蛋白的晶體學(xué)相關(guān)研究.pdf

1、摘 要病毒的調(diào) 控蛋白 在病毒的 基因 表達(dá)與調(diào) 控過(guò)程中具有重要的 作用。 B o r f - 1是牛泡沫病毒編碼的 唯一調(diào)控蛋白，能夠反式激活位于長(zhǎng)末端重復(fù)序列和 e n v基因內(nèi) 部的 啟動(dòng)子。 J D V T A T 是 J e m b r a n a D i s e a s e V i r u s 編碼的反式調(diào)控因子可以 通過(guò)結(jié)合 R N A 的T A R 序列提高轉(zhuǎn)錄效率。 工 C P O 和 B 工 C P O 分

2、別是人疙疹病毒和牛疙疹病毒編碼的調(diào)節(jié)蛋白 可以促進(jìn)病毒基因的表達(dá)。本文以這上述四 種蛋白為材料， 經(jīng) P C R 構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒， 并利用大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)。 通過(guò) 對(duì)誘導(dǎo) 條件的 優(yōu)化獲得可 溶性表達(dá)蛋白 ， 結(jié)果B o r f - 1 和工 C P O N 端片斷在 3 7 ℃即能 夠可溶性 表達(dá)，而 J D V T A T 和B I C P O 需要進(jìn)行低溫誘導(dǎo)在 1 8 ℃進(jìn)行可溶性表達(dá)。 在此基 礎(chǔ)上根據(jù)不同蛋白的 特性利用親合

3、層析， 離子交換層析和分子排阻 層析等方法對(duì)蛋白 進(jìn)行純化， 通過(guò)優(yōu)化條件，四種蛋白 均獲得較高純度。對(duì)于純化效果理想的 B o r f - 1 進(jìn)行結(jié)晶相關(guān)研究， 運(yùn)用動(dòng)態(tài)光散射和圓二色譜的 方法對(duì)分子的均一性和二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定。 發(fā)現(xiàn)在溶液中B o r f - I 是以多聚體的形式存在的， 其二級(jí)結(jié)構(gòu)中 a螺旋的 含量較低。 利用氣相擴(kuò)散法進(jìn)行B o r f - 1的晶 體生 長(zhǎng)， 摸索晶 體生長(zhǎng)的 條 件。 實(shí) 驗(yàn) 發(fā) 現(xiàn)B o

4、r f - 1 在以 聚乙 二醇 ( P E G ) 作為沉淀劑時(shí)，生成了 類似晶體的 沉淀， 并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行晶體生長(zhǎng)條件的優(yōu)化。關(guān)鍵詞: 病毒調(diào)控蛋白，蛋白 表達(dá)， 蛋白 純化， 氣相擴(kuò)散法，結(jié)晶南開(kāi)大學(xué)碩士畢業(yè) ( 學(xué)位)論文 前言1 . 前 言1 . 1 蛋白 質(zhì)晶體學(xué)的 基本原理和實(shí)驗(yàn)方法1 . 1 . 1蛋白 質(zhì)結(jié)晶的 基本原理及主要影響因素生物大分子 ( 包括蛋白 質(zhì)， 多膚， 核酸和多糖等) 及其復(fù)合體是細(xì)胞生命功能實(shí)現(xiàn)

5、的 基礎(chǔ)， 生物大分子要發(fā)揮其生物學(xué)功能需要具備穩(wěn)定的 特征的三維結(jié) 構(gòu)及三維結(jié)構(gòu)在各個(gè)水平的 運(yùn)動(dòng)， 探求結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系是當(dāng) 代分子生物學(xué)的中心問(wèn) 題之一。 解析生物大分子的 三維結(jié)構(gòu)能夠?yàn)?認(rèn)識(shí)其功能提供新的 視點(diǎn)， 并有助于解釋己 經(jīng)積累多年的生化數(shù)據(jù)。 而且， 精確的 三維結(jié)構(gòu)也是定點(diǎn)突變和分子設(shè)計(jì)的 基礎(chǔ)。 迄今為止，已 有相當(dāng)多的生物大分 子的結(jié)構(gòu)得到解析 〔 截止 2 0 0 4 年4 月， P D B 中的結(jié)構(gòu)己 經(jīng)超

6、過(guò) 2 5 , 0 0 4 個(gè)) ， 其中 大多數(shù)的生物功能已 經(jīng)得到了 深入研究， 并基于結(jié)構(gòu)對(duì)這些生物大分子進(jìn)行了 分類和相互關(guān)系的 研究。蛋白 質(zhì)結(jié)構(gòu)的 研究手段主要包括X 射線衍 射、 核磁共振 ( N M R ) 、 三維電 鏡重組及中 子衍射等。目 前應(yīng)用最廣泛的是X 射線晶 體衍射和核磁共振 ( N M R ) .X 一 射線晶 體學(xué)適用于研究各種大小蛋白 質(zhì)的結(jié)構(gòu)， 細(xì)菌核糖體 3 0 S 小亞基和5 0 S 大亞基的

7、晶體結(jié)構(gòu)解析己 經(jīng)先后完成。 X 一 射線晶體學(xué)曾經(jīng)是蛋白 質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定的唯一手段， 在現(xiàn)在 和可見(jiàn)的 將來(lái)仍將是原子 水平上解析蛋白 質(zhì)結(jié)構(gòu)的最主要和最有效的 手 段。 ( W i m b e r l y B T e t . a l , 2 0 0 0 )要 解析蛋白 質(zhì)的結(jié)構(gòu)， 首先要得到高 分辨 率的蛋白 質(zhì)晶 體。 與小分子結(jié)晶一樣， 蛋白 質(zhì)在溶液中 達(dá)到過(guò)飽和狀態(tài)時(shí)， 分子 之間可以以 規(guī)則的方式堆積起來(lái)形成晶體析出，

8、 也可以以無(wú)規(guī)則堆積方式形成沉淀。 蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)研究， 簡(jiǎn)而言之，就是尋找合適的溶液條件和合適的方法， 使蛋白 質(zhì)在過(guò)飽和溶液中以晶體形式析出， 而不是形成沉淀。 不同的蛋白 質(zhì)具有不同 的性質(zhì)， 蛋白質(zhì)結(jié)晶沒(méi)有什么一成不變的 規(guī)律可言。 要得到蛋白 質(zhì)的結(jié)晶， 需要 解決從蛋白克隆、 表達(dá)、 純化， 到結(jié)晶條件篩選、條件優(yōu)化、等環(huán)節(jié)中可能出 現(xiàn)的問(wèn) 題:① 蛋白 質(zhì)純度對(duì)結(jié)晶的影響蛋白 質(zhì)結(jié)晶過(guò)程中， 雜質(zhì)、 晶核， 還有其他一些未知