水稻花粉外壁缺陷(DPW)蛋白的晶體學(xué)與雙功能酶活性研究.pdf

1、脂肪醇及其衍生物廣泛存在于植物、動物及藻類中，是許多生物體表脂類的重要組分，其參與組成了植物的角質(zhì)及蠟質(zhì)等成分，對于花粉外壁及花藥表皮等組織的正常形成具有非常重要的作用。在植物體內(nèi)，脂肪醇的生物合成主要是由脂酰還原酶將脂酰ACP或脂酰CoA催化還原來完成的。近來，在水稻中發(fā)現(xiàn)了一個編碼脂酰還原酶的花粉外壁缺陷DPW（Defective Pollen Wall）基因，該基因在水稻花藥絨氈層和小孢子的質(zhì)體中特異表達(dá)。dpw突變體顯示出花藥角

2、質(zhì)單體包括脂肪醇含量的明顯減少、花粉外壁和花藥絨氈層的發(fā)育異常以及雄性不育等表型。與之前已知的脂酰還原酶催化的底物是脂酰CoA不同，DPW可以將C16:0-ACP催化為C16:0脂肪醇，并且僅能利用NADPH作為其輔因子行使催化功能。
　　由于目前對于脂酰還原酶底物識別及催化相關(guān)的機制了解很少，而水稻花粉外壁缺陷蛋白DPW又是第一個被發(fā)現(xiàn)能以脂酰ACP為底物并將其還原為脂肪醇的蛋白。因此，為了解其特異識別及催化C16-ACP底物的

3、機制，本論文通過將DPW蛋白在大腸桿菌中異源表達(dá)和純化，并對晶體生長條件進(jìn)行篩選和優(yōu)化，在利用硒代衍生物晶體通過單波長反常散射法解決相位問題后，最終解析了分辨率為3.4埃米的DPW-NADPH復(fù)合體晶體結(jié)構(gòu)。
　　DPW的結(jié)構(gòu)顯示其具有SDR超家族成員的典型特征，每個晶體學(xué)不對稱單位中具有兩個DPW分子，每個分子呈一個緊湊的球形結(jié)構(gòu)，整體上可以分為氨基端結(jié)構(gòu)域和羧基端結(jié)構(gòu)域兩個部分。氨基端結(jié)構(gòu)域作為 DPW主要的結(jié)構(gòu)域，呈一個典型

4、的Rossmann折疊構(gòu)型，具有7個平行β片，兩端分別是5個和6個α螺旋。NADPH輔因子的結(jié)合及催化反應(yīng)都發(fā)生在氨基端結(jié)構(gòu)域中，羧基端結(jié)構(gòu)域則具有兩個平行β片，兩端各有三個α螺旋，可能主要負(fù)責(zé)底物的結(jié)合。
　　我們在將DPW與其它已知蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對的過程中，意外地發(fā)現(xiàn)其與一些核苷二磷酸糖類催化有關(guān)的酶具有很高的結(jié)構(gòu)相似性，推測其可能也具有催化核苷二磷酸糖類的活性。經(jīng)過對水稻dpw突變體花藥中的核苷二磷酸糖類的含量進(jìn)行分析，

5、發(fā)現(xiàn)突變體植株中的UDP葡萄糖和UDP半乳糖的含量出現(xiàn)了明顯的降低，通過體外實驗的進(jìn)一步驗證，確認(rèn)DPW蛋白是一個雙功能酶，除了具有脂酰ACP還原酶活性外，還具有UDP-葡萄糖-4-差向異構(gòu)酶的活性。
　　根據(jù)DPW-NADPH復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，我們分析預(yù)測了參與底物結(jié)合、催化以及輔因子結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基。發(fā)現(xiàn)DPW蛋白在SDR成員中高度保守的四個氨基酸殘基的位置上，僅存在酪氨酸和賴氨酸兩個氨基酸殘基完全一致，在絲氨酸的位置是一個蘇

6、氨酸，沒有與天冬酰胺位置相對應(yīng)的氨基酸殘基，此外，還缺少在SDR活性中心經(jīng)典質(zhì)子中繼系統(tǒng)中的存在的一個溶劑分子，表明雖然DPW中的蘇氨酸、絲氨酸和賴氨酸三個氨基酸殘基的位置仍很保守，但其對底物的催化機制可能存在有較大的差異。通過表達(dá)這些關(guān)鍵位點的突變蛋白并進(jìn)行脂酰ACP還原酶和UDP-葡萄糖-4-差向異構(gòu)酶的活性分析發(fā)現(xiàn)，這些氨基酸殘基對于DPW這兩個酶的活性有著不同程度的影響。
　　此外，通過預(yù)測在DPW二體接觸面上對于形成同源

7、二聚體具有重要作用的氨基酸殘基，并將其突變后進(jìn)行酶活分析，發(fā)現(xiàn)這些突變蛋白的脂酰ACP還原酶的活性幾乎完全喪失，但仍保留有部分的UDP-葡萄糖-4-差向異構(gòu)酶活性，表明同源二聚體的形成對于DPW蛋白的脂酰ACP還原酶活性更為重要。綜上所述，DPW蛋白有可能通過共用一個活性中心來行使雙功能酶的催化功能，但在底物結(jié)合方式及選擇性上存在有差異。
　　本文的實驗結(jié)果表明DPW是一個雙功能酶，同時具有脂酰ACP還原酶和UDP-葡萄糖-4-差