日糧蛋白質(zhì)水平對(duì)大鼠和仔豬機(jī)體代謝和腸道微生物的影響.pdf

1、高蛋白日糧增加腸道微生物的蛋白質(zhì)發(fā)酵，不利于仔豬腸道健康，同時(shí)會(huì)造成動(dòng)物氮排放增加和蛋白質(zhì)資源的浪費(fèi)。然而高蛋白日糧對(duì)仔豬機(jī)體代謝譜、腸道內(nèi)微生物區(qū)系和腸道上皮基因表達(dá)譜的影響不還清楚。本研究先使用大鼠模型，揭示高蛋白日糧對(duì)機(jī)體代謝和腸道穩(wěn)態(tài)的影響，為高蛋白日糧對(duì)仔豬腸道影響提供參考。同時(shí)結(jié)合前人使用高蛋白日糧對(duì)仔豬的研究結(jié)果，本研究進(jìn)一步圍繞低蛋白氨基酸平衡日糧（日糧蛋白質(zhì)水平減少4個(gè)百分點(diǎn)），探討其對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能、機(jī)體代謝和腸道微生

2、物的影響。試驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1高蛋白日糧對(duì)大鼠機(jī)體代謝的影響
　　高蛋白低碳水化合物日糧能夠引起體重降低，然而高蛋白日糧對(duì)機(jī)體整體代謝的影響還不清楚。本文旨在使用生化分析和代謝組學(xué)方法，研究高蛋白日糧對(duì)大鼠機(jī)體代謝的影響。選取20只體重180-200 g的雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分成2組:正常蛋白日糧組（20％蛋白質(zhì)，56％碳水化合物）和高蛋白日糧組（45％蛋白質(zhì)，30％碳水化合物），兩種日糧的能量和脂肪水平一致，每組1

3、0個(gè)重復(fù)，飼養(yǎng)周期為6周，試驗(yàn)期結(jié)束后，采集大鼠血漿、尿液，用于生化指標(biāo)和液相色譜-質(zhì)譜代謝組學(xué)分析;采集組織器官，稱重。結(jié)果顯示，高蛋白日糧組大鼠體重、腸系膜脂肪組織和附睪脂肪重量顯著低于正常蛋白日糧組(P＜0.05)，采食量和能量攝入降低。與正常蛋白日糧組相比，高蛋白日糧增加了血漿尿素和高密度脂蛋白濃度，減少了血漿甘油三酯和葡萄糖濃度(P＜0.05)。代謝組學(xué)分析表明，高蛋白日糧顯著改變機(jī)體的代謝譜特征。高蛋白日糧增加血漿中生育酚、

4、丙酮酸、2-羰基異己酸和β-羥基丁酸相對(duì)濃度(P＜0.05)，減少了亞油酸、棕櫚酸、α-甘油磷酸和丙谷氨酸等物質(zhì)的相對(duì)濃度(P＜0.05);高蛋白日糧減少尿液中能量代謝相關(guān)的物質(zhì)，如檸檬酸、α-酮戊二酸、蘋果酸的相對(duì)濃度，增加棕櫚酸和硬脂酸相對(duì)濃度(P＜0.05)。高蛋白日糧改變了機(jī)體多種代謝途徑，包括三羧酸循環(huán)、胰島素信號(hào)和糖酵解等過程。代謝標(biāo)記物分析發(fā)現(xiàn)血漿中的尿素和丙酮酸，以及尿液中的檸檬酸能夠作為高蛋白日糧攝八的代謝標(biāo)志物?；?/p>

5、相關(guān)性的代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，攝入高蛋白日糧后，血漿中代謝物之間的相關(guān)性增加，血漿中能量代謝相關(guān)的α-酮戊二酸與血漿中苯丙氨酸、蛋氨酸和色氨酸呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)(P＜0.05)。在正常蛋白組，血漿中的纈氨酸和尿液中的β-羥基丁酸呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）;在高蛋白組，血漿中的2-羰基異己酸和尿液中的丙酮酸以及絲氨酸呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。以上結(jié)果表明，高蛋白日糧顯著改變了機(jī)體的代謝表型，影響機(jī)體能量代謝和脂肪代謝等過程。
　　2

6、高蛋白日糧對(duì)大鼠糞樣微生物區(qū)系的影響
　　日糧蛋白質(zhì)水平的變化可能引起腸道微生物組成的變化。本文旨在研究高蛋白日糧飼喂過程中，大鼠腸道微生物定植的變化。在正式試驗(yàn)的第0、1、2、4、6周的最后一天采集大鼠糞樣，通過PCR-DGGE、實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析糞樣微生物組成，氣相色譜法分析腸道微生物代謝物的變化。DGGE分析表明高蛋白日糧改變糞樣中微生物區(qū)系。高蛋白日糧增加大鼠糞樣中Dorea，Coprococcus屬的某些細(xì)菌，減少F

7、lavonifractor，Blautia，Akkermansia屬細(xì)菌。定量PCR分析表明高蛋白日糧增加大腸桿菌屬細(xì)菌數(shù)量，減少雙歧桿菌屬和Akkermansiamuciniphila細(xì)菌數(shù)量(P＜0.05)。氣相色譜分析顯示高蛋白日糧顯著減少糞樣中短鏈脂肪酸乙酸、丙酸、丁酸的濃度(P＜0.05)。以上結(jié)果表明，高蛋白日糧改變了大鼠糞樣中微生物區(qū)系，其中潛在致病菌的增加和有益菌的減少暗示高蛋白日糧可能破壞腸道穩(wěn)定。
　　3高蛋白

8、日糧對(duì)大鼠結(jié)腸微生物及代謝的影響
　　糞樣微生物的變化表明日糧對(duì)腸道微生物的改變，而高蛋白日糧對(duì)大鼠結(jié)腸微生物組成及代謝的影響還不清楚。本文通過高通量測(cè)序和微生物代謝產(chǎn)物分析，研究高蛋白日糧對(duì)腸道環(huán)境的改變。大鼠采食不同蛋白質(zhì)水平日糧6周后，采集結(jié)腸食糜，提取基因組DNA，使用16S核糖體RNA高通量測(cè)序分析結(jié)腸微生物組成，結(jié)合氣相色譜和液相色譜方法分析微生物代謝物的變化，并對(duì)食糜中游離的代謝物進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，高蛋白日糧增加結(jié)

9、腸微生物區(qū)系的多樣性(P＜0.05)，在屬水平上，高蛋白日糧增加結(jié)腸中大腸桿菌屬、腸球菌屬、鏈球菌屬、擬桿菌屬以及硫酸鹽還原菌等細(xì)菌，減少雙歧桿菌屬和瘤胃球菌屬等細(xì)菌(P＜0.05);在細(xì)菌種水平上，高蛋白日糧增加Escherichia coli，Bacteroides vulgatus，Enterococcus faecium等細(xì)菌，減少Ruminococcus bromii，F(xiàn)aecalibacteriumprausnitzii和A

10、kkermansia muciniphila等細(xì)菌(P＜0.05)。高蛋白日糧增加結(jié)腸食糜中尸胺、精胺和硫化物濃度，減少丁酸濃度（P＜0.05）。高蛋白日糧增加結(jié)腸食糜中氨基酸和核酸代謝物的相對(duì)濃度，減少脂肪酸類物質(zhì)的相對(duì)濃度(P＜0.05)。以上結(jié)果表明，高蛋白日糧導(dǎo)致結(jié)腸食糜中對(duì)腸道健康具有不利作用的細(xì)菌和代謝物增加，影響腸道健康。
　　4高蛋白日糧對(duì)大鼠結(jié)腸上皮代謝和免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　大鼠結(jié)腸微生物和代謝物的

11、變化可能對(duì)腸道上皮產(chǎn)生影響。本文通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法，研究高蛋白日糧對(duì)結(jié)腸上皮代謝和免疫相關(guān)基因的影響。采集飼喂6周后大鼠的結(jié)腸上皮組織，提取總RNA，進(jìn)行基因芯片和熒光定量PCR分析。通過基因芯片技術(shù)篩選出差異基因，使用DAVID和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行富集分析。結(jié)果顯示，高蛋白日糧上調(diào)參與疾病發(fā)生過程的基因表達(dá)（P＜0.05），包括趨化應(yīng)答，腫瘤壞死因子α信號(hào)過程，氧化應(yīng)激和凋亡。高蛋白日糧下調(diào)參與免疫保護(hù)過程的基因表達(dá)(P＜0.05)，包

12、括固有免疫，氧連接的粘蛋白糖基化，氧化磷酸化。對(duì)基因表達(dá)、微生物和代謝物進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌屬、腸球菌屬和鏈球菌屬細(xì)菌的豐度和參與趨化作用、腫瘤壞死因子信號(hào)途徑、抗原提呈過程的基因存在顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），暗示這些細(xì)菌可能介導(dǎo)高蛋白日糧對(duì)結(jié)腸的不利影響。以上結(jié)果表明，高蛋白日糧可能改變大鼠結(jié)腸上皮免疫和代謝穩(wěn)定，增加疾病風(fēng)險(xiǎn)。
　　5低蛋白氨基酸平衡日糧對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能和血清生化指標(biāo)的影響
　　為了研究低蛋白

13、氨基酸平衡日糧對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能和血清生化指標(biāo)的影響。試驗(yàn)選用體重相近（12.02±0.52 kg）的健康杜長(zhǎng)大生長(zhǎng)豬，分為2組:正常蛋白組（20％蛋白質(zhì)），低蛋白氨基酸平衡日糧（16％蛋白質(zhì)）。每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8-10頭豬，試驗(yàn)期35天，在77日齡屠宰采樣。結(jié)果顯示，低蛋白氨基酸平衡日糧對(duì)生長(zhǎng)性能無(wú)顯著影響，顯著減少粗脂肪的表現(xiàn)消化率（P＜0.05），顯著減少胰腺重量（P＜0.05），顯著減少血清葡萄糖和膽固醇的濃度(P＜0.05)

14、。氨基酸分析顯示，低蛋白氨基酸平衡日糧顯著減少血清中總氨基酸和總必需氨基酸濃度(P＜0.05)，顯著減少血清中苯丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、組氨酸和精氨酸濃度(P＜0.05)，對(duì)色氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺濃度無(wú)顯著影響(P＞0.05)。低蛋白氨基酸平衡日糧顯著減少回腸食糜中色氨酸、賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸的濃度（P＜0.05），對(duì)其他

15、氨基酸的濃度無(wú)顯著影響(P＞0.05)。以上結(jié)果表明，低蛋白氨基酸平衡日糧對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能無(wú)顯著影響，降低血清和回腸食糜中氨基酸濃度，影響仔豬支鏈氨基酸代謝等過程。
　　6低蛋白氨基酸平衡日糧對(duì)仔豬血清代謝譜的影響
　　本試驗(yàn)使用高通量代謝組學(xué)技術(shù)，研究低蛋白氨基酸平衡日糧對(duì)仔豬血清代謝譜的影響。采集77日齡仔豬的血清樣品，用于氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜分析。結(jié)果表明，低蛋白氨基酸平衡日糧改變血清中代謝物組成。PLS-DA和OPL

16、S-DA分析表明低蛋白氨基酸平衡日糧組和正常蛋白紐處于不同的聚類簇。和正常蛋白日糧相比，低蛋白氨基酸平衡日糧顯著增加血清中單甘油棕櫚酸、甘油、硬脂酸、β-丙氨酸、丙二酸和棕櫚酸的相對(duì)濃度(P＜0.05)，顯著減少血清中瓜氨酸、鳥氨酸、哌啶甲酸和酪氨酸的相對(duì)濃度(P＜0.05)。代謝物富集分析顯示低蛋白氨基酸平衡日糧顯著影響了與丙酸代謝、甘油酯代謝、脂肪酸代謝、線粒體脂肪酸延伸和兒荼酚胺合成等有關(guān)的過程(P＜0.05)。受試者工作特征分析

17、顯示結(jié)合鳥氨酸、瓜氨酸、β-丙氨酸和酪氨酸四種氨基酸代謝類物質(zhì)，能夠很好的區(qū)分正常蛋白組和低蛋白氨基酸平衡日糧組。以上結(jié)果表明，低蛋白氨基酸平衡日糧主要影響仔豬體內(nèi)精氨酸代謝、β-丙氨酸代謝、脂肪酸代謝、微生物賴氨酸代謝和酪氨酸代謝等過程，對(duì)能量代謝過程無(wú)顯著影響。
　　7低蛋白氨基酸平衡日糧對(duì)仔豬腸道微生物及腸道上皮基因表達(dá)影響
　　本文旨在研究低蛋白氨基酸平衡日糧對(duì)仔豬回腸和結(jié)腸食糜微生物區(qū)系及腸上皮的影響。采集77日齡

18、仔豬回腸和結(jié)腸食糜分析主要微生物組成和代謝產(chǎn)物，采集腸黏膜組織分析炎癥因子的基因表達(dá)。結(jié)果顯示，低蛋白氨基酸平衡日糧對(duì)回腸和結(jié)腸的影響不同。低蛋白氨基酸平衡日糧對(duì)回腸微生物數(shù)目無(wú)顯著影響(P＞0.05)，顯著減少回腸食糜中氨氮、酪胺、亞精胺濃度（P＜0.05），顯著增加回腸食糜中色胺濃度(P＜0.05)，下調(diào)回腸黏膜Tlr5和Ifnγ mRNA的表達(dá)（P＜0.05）。在結(jié)腸，低蛋白氨基酸平衡日糧顯著減少總菌和厚壁菌門細(xì)菌的數(shù)目(P＜0.

19、05)，增加結(jié)腸食糜中氨氮、丁酸、對(duì)甲酚和吲哚濃度(P＜0.05)，對(duì)結(jié)腸食糜中生物胺的濃度無(wú)顯著影響(P＞0.05)，對(duì)結(jié)腸黏膜細(xì)胞因子的表達(dá)無(wú)顯著影響(P＞0.05)。低蛋白氨基酸平衡日糧對(duì)回腸和結(jié)腸食糜中乳酸桿菌屬和雙歧桿菌屬細(xì)菌的數(shù)量無(wú)顯著影響(P＞0.05)。低蛋白氨基酸平衡日糧對(duì)黏膜免疫球蛋白的表達(dá)無(wú)顯著影響(P＞0.05)。以上結(jié)果表明，低蛋白氨基酸平衡日糧對(duì)仔豬的微生物組成和代謝的影響存在腸段差異，減少回腸食糜中蛋白質(zhì)發(fā)