SAM-IV核糖開關(guān)的結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、核酸開關(guān)（Riboswitch）是一類天然存在的RNA傳感元件和基因調(diào)控因子，其通常與體內(nèi)一系列小分子代謝物互作，隨即促發(fā)mRNA非編碼區(qū)（5'端）應(yīng)答性變構(gòu)而調(diào)控基因表達(dá)過程。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，核酸開關(guān)介導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)控是一種古老的分子調(diào)控模式，無需蛋白質(zhì)協(xié)助。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)的核酸開關(guān)主要來源于低等生物群落，尚未在人類體內(nèi)發(fā)現(xiàn)類似的功能結(jié)構(gòu)單元。
　　目前，S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine, SAM）核糖

2、開關(guān)家族的研究最為廣泛。SAM核糖開關(guān)是迄今發(fā)現(xiàn)的最大核糖開關(guān)家族，因其結(jié)合同一配體“SAM”而得名，它包含SAM-Ⅰ～SAM-Ⅴ五種亞型， S-box（SAM-Ⅰ）、SMK（SAM-Ⅲ）兩個(gè)亞型的研究較為深入，而SAM-Ⅳ、SAM-Ⅴ結(jié)構(gòu)與功能信息卻知之甚少。SAM核糖開關(guān)各亞型結(jié)構(gòu)和來源各異，甚至調(diào)控機(jī)理也不盡相同。廣泛的生化、結(jié)構(gòu)和遺傳學(xué)研究已建立了核糖開關(guān)在生命體內(nèi)發(fā)揮功能的基本原理，這對開發(fā)抗生素、設(shè)計(jì)新型分子傳感器、以及將核

3、糖開關(guān)整合進(jìn)合成回路具有重要的指導(dǎo)意義。
　　本課題主要集中在SAM-Ⅳ的結(jié)構(gòu)和功能研究上。首先，利用核酸結(jié)晶測試技術(shù)獲取SAM-Ⅳ與相應(yīng)調(diào)控分子互作的三維結(jié)構(gòu)信息，本階段主要完成多種SAM-Ⅳ RNA結(jié)晶體制備，為后續(xù)結(jié)晶測試奠定基礎(chǔ)。本研究工作是基于“天藍(lán)色鏈霉菌”（Streptomyces coelicolor,Sc），“金黃節(jié)桿菌”（Arthrobacter aurescens,Aau），“節(jié)桿菌”（Arthrobacte

4、r sp.，Asp）等野生型菌株的SAM-Ⅳ基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，通過構(gòu)建體外高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，經(jīng)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄獲取轉(zhuǎn)錄本（SAM-Ⅳ RNA），再經(jīng)分離純化和回收獲取高純度樣品，以備結(jié)晶測試之用。其次，基于SAM-Ⅳ RNA進(jìn)行SHAPE分析。SHAPE分析結(jié)果顯示，SAM的存在使SAM-Ⅳ的RNA二級，三級結(jié)構(gòu)及預(yù)測的結(jié)合核心結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，同時(shí)SAM的結(jié)合依賴于P5部分的參與。推測其存在SAM依賴性分子調(diào)控機(jī)制，從而為SAM-Ⅳ核酸開關(guān)調(diào)控機(jī)

5、理研究奠定了基礎(chǔ)。整體工作分為三部分，具體如下：
　　1. SAMⅣ RNA制備與結(jié)晶
　　首先，基于野生型SAM-Ⅳ RNA序列信息進(jìn)行模板優(yōu)化設(shè)計(jì)，其主要原則：1）保留核心功能區(qū)，剔除部分非功能區(qū)，并將部分非致死位堿基A，U突變?yōu)榉€(wěn)定性更高的堿基G，C；2）在構(gòu)型兩側(cè)插入丁型肝炎病毒核酸酶（HDV ribozyme）及錘頭狀核酶（Hammerhead ribozyme）序列，以便于獲取準(zhǔn)確的目的片段。
　　隨后，由

6、上海生工合成部代理合成優(yōu)化模板序列，構(gòu)建重組質(zhì)粒。再經(jīng)PCR擴(kuò)增技術(shù)獲取大量SAM-Ⅳ優(yōu)化模板，進(jìn)而利用構(gòu)建好的體外轉(zhuǎn)錄體系經(jīng)高效轉(zhuǎn)錄獲取足量RNA，在轉(zhuǎn)錄體系中由于核酶的自剪切作用，將目的序列準(zhǔn)確切下，經(jīng)由變性尿素-聚丙烯酰胺凝膠（Urea-PAGE）將產(chǎn)物分離純化，通過膠回收后轉(zhuǎn)入超濾離心管將目的樣品進(jìn)一步純化，獲得高純轉(zhuǎn)錄本。而后將純化所得RNA樣本經(jīng)重折疊后，由懸浮蒸汽擴(kuò)散法（hanging drop vapor diffusi

7、on method）獲得并篩選晶體。在實(shí)驗(yàn)中，初步測試了晶體條件，獲得了部分SAM-Ⅳ晶體。
　　2. SAM-Ⅳ結(jié)構(gòu)優(yōu)化及SHAPE分析
　　根據(jù)不同種菌體的SAM-Ⅳ核糖開關(guān)設(shè)計(jì)不同的突變構(gòu)型，并對用于SHAPE分析的核糖開關(guān)結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，以甄別各部分的功能及核糖開關(guān)作用機(jī)理。SAM-Ⅳ RNA準(zhǔn)備同前，由生物公司合成并插入質(zhì)粒，得到pUC57_SAM-Ⅳ_SHAPE模板，再經(jīng)PCR、體外轉(zhuǎn)錄、膠分離純化回收等步驟獲得高

8、純樣本RNA。最后通過SHAPE分析實(shí)驗(yàn)及測序儀分析得知SAM的存在使SAM-Ⅳ RNA折疊及整體三維結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，同時(shí)精確定位了SAM-Ⅳ RNA與SAM的結(jié)合位點(diǎn)。而且還揭示了SAM的結(jié)合依賴于SAM-Ⅳ構(gòu)型中P5部分的參與，推測其分子調(diào)節(jié)的機(jī)制跟P5部分有直接關(guān)系。
　　3.體外轉(zhuǎn)錄體系優(yōu)化
　　優(yōu)化體外轉(zhuǎn)錄體系，旨在高效獲取RNA產(chǎn)物。體外轉(zhuǎn)錄被廣泛用于分子生物學(xué)及結(jié)構(gòu)生物學(xué)。鑒于一般轉(zhuǎn)錄RNA產(chǎn)量較低，故針對其部分

9、條件進(jìn)行優(yōu)化，包括鎂離子補(bǔ)加時(shí)間，鎂離子補(bǔ)加濃度，NTP加入濃度，NTP補(bǔ)加濃度，反應(yīng)總時(shí)間及無機(jī)焦磷酸酶等幾個(gè)方面。實(shí)驗(yàn)中利用所掌握的資料及專業(yè)知識(shí)確定影響因素并設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，再通過方差分析，多重比較等方法得到了優(yōu)化結(jié)果，即補(bǔ)加時(shí)間，M g2+補(bǔ)加濃度，反應(yīng)總時(shí)間，無機(jī)焦磷酸酶的添加等方面不對結(jié)果造成影響，屬次要因素，NTP補(bǔ)加濃度為20mM/L，NTP加入濃度為25mM/Lamp;nbsp;時(shí)，RNA產(chǎn)量提升了300％。
　　

10、本課題旨在利用晶體測試及SHAPE分析對SAM-Ⅳ核糖開關(guān)的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究。同時(shí)，還對體外轉(zhuǎn)錄體系進(jìn)行優(yōu)化，提升了RNA的產(chǎn)量。實(shí)驗(yàn)中通過優(yōu)化SAM-Ⅳ核糖開關(guān)的結(jié)構(gòu)，利用結(jié)晶測試獲得了部分 RNA晶體，且經(jīng) SHAPE數(shù)據(jù)分析，得知 SAM能夠穩(wěn)定SAM-Ⅳ的整體結(jié)構(gòu)，并且準(zhǔn)確定位了SAM-Ⅳ的SAM結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)P5在SAM的結(jié)合過程中有重要作用。并且經(jīng)正交實(shí)驗(yàn)分析確定體外轉(zhuǎn)錄體系中當(dāng)NTP補(bǔ)加濃度為20mM/L，NTP加入