人工核酶核糖開關(guān)調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達(dá)的性能及優(yōu)化.pdf

1、轉(zhuǎn)基因的表達(dá)調(diào)控，在基因治療中起著舉足輕重的作用。隨著對(duì)RNA功能研究的日益深入，越來越多的研究者在選擇調(diào)控工具時(shí)，將目光轉(zhuǎn)向非編碼RNA（noncoding RNA，ncRNA）。尤其是小的人工合成的ncRNA，工作效率高、免疫原性低，可以作為理想的基因治療調(diào)控工具。而核糖開關(guān)（riboswitch）的發(fā)現(xiàn)，又為ncRNA在基因表達(dá)調(diào)控中的研究和應(yīng)用翻開了新篇章。
　　核糖開關(guān)由適體和表達(dá)平臺(tái)兩部分序列構(gòu)成。適體域與其相應(yīng)配體的

2、結(jié)合可引起整個(gè)核糖開關(guān)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，從而控制轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。配體的結(jié)合可引起轉(zhuǎn)基因表達(dá)量上升的核糖開關(guān)為ON型開關(guān)，反之為OFF型開關(guān)。人工構(gòu)建的核糖開關(guān)，即根據(jù)其自然構(gòu)成方式進(jìn)行設(shè)計(jì)。核酶型核糖開關(guān)（或核酶核糖開關(guān)，簡(jiǎn)稱核酶開關(guān)），使用核酶作為表達(dá)平臺(tái)，通過調(diào)控核酶自身剪切的能力來控制轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。因其結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制都較為簡(jiǎn)單，成為目前研究的熱點(diǎn)。
　　本文介紹的HTRS-1（Hammerhead Theophylline Ri

3、boswitch1）型核酶開關(guān)，通過人工合理設(shè)計(jì)，由茶堿適體和煙草環(huán)斑病毒錘頭狀核酶構(gòu)成，屬于ON型核糖開關(guān)?？墒褂弥亟M質(zhì)粒載體或重組腺相關(guān)病毒（recombinant adeno-associ-ated virus，rAAV）進(jìn)行，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)揮作用。實(shí)驗(yàn)證明：HTRS-1核酶開關(guān)能夠針對(duì)多種轉(zhuǎn)基因、在多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)揮調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達(dá)的作用，但調(diào)控能力會(huì)因轉(zhuǎn)基因或宿主細(xì)胞種類的不同而有所改變，單個(gè)HTRS-1核酶開關(guān)對(duì)轉(zhuǎn)基因

4、表達(dá)的調(diào)控倍數(shù)約在1.7~3.7倍不等。
　　針對(duì)核酶開關(guān)調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達(dá)時(shí)存在的不足（如基礎(chǔ)表達(dá)量低，調(diào)控范圍（調(diào)控倍數(shù)）窄等），本文對(duì)HTRS-1核酶開關(guān)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了改造，包括：其催化核心環(huán)上的選擇性起始密碼子的突變消除；HTRS-1核酶開關(guān)在轉(zhuǎn)基因 UTR插入位置的篩選；多個(gè)HTRS-1核酶開關(guān)的串聯(lián)等。結(jié)果顯示：采用不同方式改造的核酶開關(guān)，調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達(dá)的效果不同。最終得到動(dòng)力學(xué)性能最好的核酶開關(guān)，是同時(shí)在轉(zhuǎn)基因序列兩端UT