PRRSV內(nèi)切核糖核酸酶nsp11結(jié)構(gòu)和功能研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）屬于尼多病毒目動脈炎病毒科成員。PRRSV是引起豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）的致病因子，PRRS已經(jīng)成為威脅世界養(yǎng)豬業(yè)重要的感染性疾病。自從1995年，我國分離到第一株P(guān)RRSV毒株以來，特別是在2006年

2、爆發(fā)（2009-2010年間重新爆發(fā)）的高致病性PRRSV(HP-PRRSV)已經(jīng)給我國養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。由于PRRSV基因組的不斷變異，目前尚缺乏有效的疫苗和藥物用于PRRSV的防控。Nsp11作為PRRSV自身編碼的內(nèi)切核糖核酸酶，它具有尼多病毒目病毒特有的能夠特異性切割尿嘧啶的內(nèi)切核糖核酸酶(NendoU)活性，這一功能對動脈炎病毒的復(fù)制非常重要。本研究中，我們成功解析了動脈炎病毒科的第一個內(nèi)切核糖核酸酶nsp11的結(jié)構(gòu)并闡

3、明了它以二聚體方式行使NemdoU功能的作用機制，為抗病毒藥物的研發(fā)提供新思路。具體的研究內(nèi)容如下:
　　1.湖北省種豬場PRRSV流行病學調(diào)查及分子變異分析
　　我們對湖北地區(qū)的14個規(guī)模化種豬場PRRSV流行情況分析表明:在檢測的668份樣品中，PRRSV陽性率為5.24％(35/668)，C-PRRSV和HP-PRRSV的陽性率分別為為1.95％(13/668)、3.59％(24/668)。HP-PRRSV已經(jīng)成為該地

4、區(qū)主要流行的PRRSV毒株。同時，我們通過對PRRSV的nsp2、orf5和orf7的全長基因進行測序，并分析了該地區(qū)PRRSV毒株基因變異情況。氨基酸序列分析表明:該地區(qū)多數(shù)HP-PRRSV毒株和JXA1株都在Nsp2編碼區(qū)域的480位和532-560位不連續(xù)缺失30氨基酸表位，該結(jié)果證實了本試驗調(diào)查的7株P(guān)RRSV毒株屬于HP-PRRSV毒株。同時，Nsp2編碼區(qū)域缺失59或68個氨基酸表位的毒株也被發(fā)現(xiàn)，表明其他類型的PRRSV缺

5、失毒株也流行于該地區(qū)。基于orf5基因的進化樹分析表明:2009-2010年間的湖北分離株形成一個獨立的分支。它們與JXA1株相比，在凋亡表位存在突變(Va129→Ala29)。再者，GP5蛋白中潛在糖基化位點的數(shù)目呈增加趨勢。同時，我們發(fā)現(xiàn)GP5蛋白中也存在大量的變異，發(fā)生在初級中和表位的突變(Phe39/Leu39→IIe39、Leu41→Ser41)和增加的糖基化位點數(shù)目可能是導(dǎo)致該地區(qū)PRRSV野毒株能夠逃避疫苗中和作用的原因之

6、一。最后，我們也發(fā)現(xiàn)在N蛋白中多數(shù)的突變發(fā)生在氨基酸表位:Arg11→Lys11、Asp15→Asn15、Lys46→Arg46、Thr91→Ala91、His109→Gln109和Val117→Ala117。
　　綜上所述，我們調(diào)查了PRRSV在湖北地區(qū)種豬場的流行情況，并分析了2006-2012年間PRRSV流行毒株的分子變異情況，為有效控制湖北地區(qū)PRRSV的流行提供理論基礎(chǔ)。
　　2.PRRSV內(nèi)切核糖核酸酶nsp1

7、1結(jié)構(gòu)和功能研究
　　成功解析了動脈炎病毒科第一個內(nèi)切核糖核酸酶nsp11的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)。Nsp11的晶體結(jié)構(gòu)為全新的結(jié)構(gòu)，它存在兩個不對稱的nsp11單體分子，這與冠狀病毒nsp15的六聚體晶體結(jié)構(gòu)完全不同。但是，PRRSV nsp11和冠狀病毒nsp15結(jié)構(gòu)比較中，羧基端“catalytic domain”較為保守，特別是與內(nèi)切核糖核酸酶功能相關(guān)的兩個loop結(jié)構(gòu):“active site loop”(His129-His1

8、44)和“supporting loop”（Val162-Thr179）。再者，結(jié)構(gòu)同源性分析都證實了nsp11的關(guān)鍵酶活位點His129、His144、Lys173、Thr177、Asp180、Asp204和Tyr219與冠狀病毒nsp15具有較高的保守性。這表明，動脈炎病毒屬和冠狀病毒屬的NendoU可能具有相似的RNA底物裂解機制。
　　PRRSVnsp11以二聚體形式行使NendoU功能，這與冠狀病毒nsp15以六聚體發(fā)揮

9、功能的方式完全不同。首先，我們通過生化試驗證實了純化后的nsp11蛋白主要以二聚體形式存在于溶液中。其次，我們通過PDBePISA在線軟件分析了nsp11二聚體界面相互作用氨基酸表位，并通過生化試驗證明了Ser74和Phe76突變?yōu)锳la后，破壞了nsp11穩(wěn)定的二聚體結(jié)構(gòu)并導(dǎo)致NendoU活性顯著降低，這表明nsp11可能以二聚體形式發(fā)揮功能。在nsp11的晶體結(jié)構(gòu)中，我們發(fā)現(xiàn)“active site loop”和“supportin

10、g loop”的穩(wěn)定是nsp11發(fā)揮功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，而它們結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定需要相鄰的nsp11單體通過氫鍵和疏水作用力提供支撐作用。
　　通過生化試驗分析了PRRSV nsp11的NendoU活性的作用機制。首先，我們通過FRET試驗分析了nsp11野生型和突變體(H129A、K173A、T177A和Y219A)的NendoU活性。與野生型蛋白相比，突變體蛋白的NendoU活性顯著降低。我們的實驗結(jié)果表明這些氨基酸表位是重要的Nendo

11、U催化位點。其次，結(jié)構(gòu)分析表明三個潛在的催化氨基酸表位（His129、His144和Lys173）位于catalytic domain并包圍一個帶正電荷的溝槽，其中Thr177位于溝槽的中間。我們發(fā)現(xiàn)H129A突變體蛋白的NendoU活性較低，這可能與His129在裂解RNA底物過程中具有接收質(zhì)子的功能有關(guān)。另外，Thr177和Tyr219可能對于RNA底物的識別和綁定起著重要的作用。與野生型蛋白相比，突變體蛋白(T177A和Y219A

12、)的催化活性顯著降低。
　　發(fā)現(xiàn)PRRSV nsp11潛在的細胞毒性可能抑制了IFN-β啟動子的激活。在HEK293T細胞中過表達野生型nsp11顯著抑制SEV對IFN-β和IRF3啟動子的激活，但突變體(S74A、F76A、H129A、K173A、T177A和Y219A)部分失去了抑制作用。然而，過表達野生型nsp11導(dǎo)致報告基因的內(nèi)參值(pRL-TK)的顯著降低，這表明野生型nsp11抑制了宿主基因表達。巧合的是，突變體基因過