基于直接藍71免洗脫染色的蛋白質免疫印跡內參方法學研究.pdf

1、研究背景：
　　近30年來，蛋白質免疫印跡(Western Blotting)一直作為一項常規(guī)實驗技術，在生命科學研究領域中被廣泛應用。其包括凝膠電泳分離，及后續(xù)的免疫檢測兩個主要步驟。
　　Western Blotting主要用于蛋白質定性和半定量分析，即檢測樣品中目標蛋白的有無、或不同樣品中目的蛋白的差異表達水平。在定性分析中，需首先檢測泳道中是否存在蛋白，以排除系統(tǒng)非正常工作所導致的假陰性;而半定量分析時，則需要校正不

2、同樣品的上樣量以及轉印效率的差別造成的系統(tǒng)誤差。為此，實驗過程中往往需要引入合適內參(loading control)來作為體系對照。目前使用的內參主要有兩種趨勢，一種是采用傳統(tǒng)的管家基因所表達的蛋白即管家蛋白進行免疫反應，將其發(fā)光灰度值作為體系內參;另一種則是采用全蛋白染色法，即將全部上樣蛋白染色后的灰度值作為體系內參。
　　直接藍71(Direct Blue71，DB71)是一種工業(yè)常用的偶氮染料，2000年Hee-Youn

3、Hong首次發(fā)現(xiàn)該染料在酸性環(huán)境下能進行蛋白染色，并且在弱堿性環(huán)境下易于洗脫。那么，DB71染色是否能作為一種Western Blotting內參，這種染色方法是否會影響后續(xù)的免疫反應，其在天然樣本中的染色范圍與線性程度等，這些問題均需進一步實驗研究。
　　目的：
　　本實驗通過與傳統(tǒng)的單一蛋白免疫內參和全蛋白染色內參進行比較，建立基于直接藍71免洗脫染色的蛋白質免疫印跡內參。
　　方法：
　　采用三種常見的神經

4、科學研究樣本（人血漿，人少突膠質瘤細胞，大鼠腦組織）系統(tǒng)評估DB71染色法作為Western Blotingt內參的可行性。其中，考馬斯亮藍作為傳統(tǒng)的全蛋白膜染色內參法，β-tubulin作為傳統(tǒng)的蛋白印記免疫內參法，維他命D結合蛋白作為日常實驗中的目的蛋白來與DB71染色法進行對照試驗。每種樣本重復上樣6次，采用相關系數評估其精確性;2.5-40μg的線性蛋白上樣，采用R2來評估方法的線性及線性范圍;共3次技術重復，采用獨立樣本T檢驗

5、來評估DB71染色法與兩組對照內參法的差異和可重復性。
　　結果：
　　(1)在少突膠質瘤細胞組中，DB71染色法的精確性和可重復性較考馬斯亮藍膜染色內參法有統(tǒng)計學差異，而大鼠腦組織和人血漿組并未表現(xiàn)明顯差異。
　　(2)在少突膠質瘤細胞組和大鼠腦組織組中，直接藍71染色法的精確性性和可重復性較β-tubulin免疫內參法有明顯優(yōu)勢，差異有統(tǒng)計學意義。
　　(3)在少突膠質瘤細胞組和大鼠腦組織組中，未洗脫的直接藍

6、71染色法的精確性和可重復性較未染色的β-tubulin組和維他命D結合蛋白組無統(tǒng)計學差異，結果表明未洗脫的直接藍71對后續(xù)的免疫反應不會造成太大干擾。
　　(4)在三組樣本的2.5-40μg上樣范圍內，直接藍71染色法線性好，與考馬斯亮藍染膜法和β-tubulin免疫內參法無統(tǒng)計學差異。在血漿樣本中，直接藍71染色法較維他命D結合蛋白組有統(tǒng)計學差異，而維他命D結合蛋白組線性較差，推測其可能在20μg已達到免疫線性上限。