牛支原體不同分離株蛋白多肽及免疫印跡的分析.pdf

1、牛支原體(Mycoplasmaboris,Mb)是感染牛的一種非常重要的致病性病原體,是引起牛的肺炎、關(guān)節(jié)炎、乳房炎、流產(chǎn)與不孕等多種疾病的主要病原之一。國(guó)內(nèi)2008年首次從患肺炎的犢牛肺臟中分離到Mb,此后在國(guó)內(nèi)開始蔓延,目前該病原在國(guó)內(nèi)外造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大。在前期研究的基礎(chǔ)之上,本文通過(guò)對(duì)全菌蛋白及膜蛋白多肽與免疫印跡的分析,旨在進(jìn)一步篩選優(yōu)勢(shì)流行菌株,并找到具有免疫原性的抗原蛋白片段,為后期ELISA診斷試劑盒的開發(fā)、疫苗的研制提

2、供理論依據(jù),也為進(jìn)一步預(yù)防和控制Mb及其他支原體病奠定理論基礎(chǔ)。
　　 1.牛支原體增值擴(kuò)培、濃度測(cè)定及PCR鑒定
　　 本試驗(yàn)采用改良的支原體培養(yǎng)基對(duì)分離自全國(guó)各地的6株Mb分離株進(jìn)行增值擴(kuò)培,通過(guò)基于Mb保守基因設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行PCR鑒定,并采用顏色改變單位(CCU)法對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行濃度測(cè)定。結(jié)果顯示,液體培養(yǎng)基24h開始變色,而48h即可達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期;6株分離株培養(yǎng)物均擴(kuò)增出預(yù)期大小(1912bp)的片段:6株

3、分離株培養(yǎng)物濃度均達(dá)108ccu/ml以上。研究發(fā)現(xiàn)改良的液體培養(yǎng)基比較適合Mb生長(zhǎng)繁殖,培養(yǎng)時(shí)間縮短;建立的MbPCR鑒定方法特異性好、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單,為后期全菌蛋白和膜蛋白的研究做準(zhǔn)備。
　　 2.牛支原體分離株全菌蛋白多肽分析
　　 通過(guò)分析比較不同Mb分離株之間全菌蛋白多肽的差異性,結(jié)合前期生長(zhǎng)特性試驗(yàn)和致病性試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步篩選優(yōu)勢(shì)流行菌株。本研究采用裂解液法對(duì)分離自全國(guó)各地的6株(分別是W70株、1738株

4、、Q3株、Q1株、JX02株、677株)Mb分離株進(jìn)行全菌蛋白的提取,通過(guò)SDS-PAGE電泳及考染分析顯示6株Mb分離株全菌蛋白多肽數(shù)量、多肽清晰度存在差異;其中W70株、1738株、Q3株和Q1株的蛋白多肽條數(shù)、分子量大小及蛋白條帶表達(dá)量基本一致,共有17條多肽條數(shù),蛋白分子量范闈在130.8kDa-23.2kDa之間;與前4株分離株相比,JX02株蛋白多肽條帶數(shù)量與分子量大小無(wú)變化,而蛋白條帶表達(dá)量低;677株蛋白多肽條帶數(shù)量以及

5、蛋白條帶表達(dá)量顯著低于前4株。研究表明W70株、1738株、Q3株和Q1株全菌蛋白表達(dá)量?jī)?yōu)于JX02株和677株?？梢宰鳛楹笃谠囼?yàn)的候選菌株。
　　 3.牛支原體分離株膜蛋白6種提取方法的比較
　　 為比較Mb膜蛋白不同提取方法的優(yōu)劣,以期篩選出較優(yōu)的Mb膜蛋白提取方法和提取組合參數(shù),本研究分別采用不同濃度TritonX-100(0.2%、0.4%、0.6%、0.8%)、不同濃度TritonX-114(1%、2%、3%、

6、4%)、不同濃度TritonX-100與不同濃度KI(0.6M、0.8M、1.8M)復(fù)合法、不同濃度TritonX-114與不同濃度KI(0.6M、0.8M、1.8M)復(fù)合法、反復(fù)凍融法、超聲裂解法等6種膜蚩白提取方法提取3株Mb分離株(W70株、1738株、Q3株)膜蛋白。各法所獲的膜蛋白經(jīng)12%SDS-PAGE電泳和Bradford法膜蛋白定量分析表明:(1)相同膜蛋白提取法不同Mb分離株之間膜蛋白SDS-PAGE圖譜無(wú)明顯差異,蛋

7、白條帶數(shù)量基本相同,但相同Mb分離株不同膜蛋白提取方法所獲膜蛋白SDS-PAGE圖譜、蛋白條帶數(shù)量和蛋白濃度差異明顯(P＜0.05)。(2)KI復(fù)合法提取Mb膜蛋白試驗(yàn)中,不同濃度KI對(duì)所獲Mb膜蛋白濃度的影響差異極顯著(P＜0.01),0.6MKI提取的膜蛋白在蛋白條帶數(shù)、蛋白條帶清晰度、蛋白濃度上效果均優(yōu)于0.8MKI,而0.8MKI又優(yōu)于1.8MKI,1.8MKI法提取效果最差。(3)分析顯示,3%tritonX-114法和0.4

8、%TritonX-100復(fù)合0.6MKI法兩法提取所獲的膜蛋白蛋白條帶數(shù)量較多、條帶清晰度較好、蛋白濃度及蛋白收集率較高,蛋白條帶數(shù)分別高達(dá)26-28條和24-28條,蛋白分子量分別在167-11.4kDa之間和170kDa-12.2kDa之間,主要蛋白分子量分別是101.4kDa、92.9kDa、85.0kDa、77.9kDa、71.3kDa、65.3kDa、45.9kDa、38.5kDa、33.8kDa、29.6kDa、27.1kD

9、a、22.7kDa、20.8kDa和101.4kDa、92.9kDa、77.9kDa、74.5kDa、65.3kDa、59.8kDa、52.4kDa、38.5kDa、33.8kDa、29.6kDa、24.8kDa、21.6kDa、19.9kDa。(4)超聲裂解及反復(fù)凍融法提取Mb膜蛋白效果一般。本研究表明3%TritonX-114或0.4%TritonX-100復(fù)合0.6MKI是Mb膜蛋白較優(yōu)的提取方法;本研究為國(guó)內(nèi)Mb膜蛋白的提取摸索

10、出了一條行之有效的路徑,并豐富了國(guó)外Mb膜蛋白提取方法部分的參數(shù)。
　　 4.牛支原體分離株全菌蛋白及膜蛋白免疫印跡(westernblot)的分析
　　 為了找到Mb全菌蛋白及膜蛋白具有免疫原性的蛋白抗原片段,為后續(xù)的Mb蛋白的研究、ELISA診斷試劑盒的開發(fā)及疫苗的研制提供理論依據(jù)。本研究采用自制的小鼠抗血清對(duì)MbW70株、1738株、Q3株、Q1株、677株、JX02株6株分離株的全菌蛋白進(jìn)行wgsternblot

11、分析;同時(shí)亦對(duì)3%TritonX-114法、0.4%TritonX-100復(fù)合0.6MKI法、0.4%TritonX-100法、3%TritonX-114復(fù)合0.6MKI法、反復(fù)凍融法和超聲裂解法6種膜蛋白提取方法所獲的W70株、1738株、Q3株3株Mb分離株膜蛋白進(jìn)行westernblot分析。結(jié)果顯示:(1)W70株、1738株、Q3株、Q1株、JX02株和677株等6株Mb分離株全菌蛋白均顯示2條相同的大小為55kDa和43kD

12、a(誤差范圍±1kDa,下同)的雜交條帶,且677株和JX02株雜交條帶的表達(dá)量弱于其他4株分離株。(2)兩種Mb膜蛋白較優(yōu)提取法(即3%TritonX-114法和0.4%TritonX-100復(fù)合0.6MKI法)所獲MbW70株、1738株及Q3株3株分離株的膜蛋白均具有3條共同的雜交條帶,即56kDa、43kDa和18kDa。(3)0.4%TritonX-100、3%TritonX-114復(fù)合0.6MKI法、超聲裂解法和反復(fù)凍融法所

13、獲的MbW70株、1738株、Q3株3株分離株的膜蛋白均顯現(xiàn)2條共同的雜交條帶,分別是55kDa和43kDa。研究表明:(1)Mb各分離株全菌蛋白及膜蛋白與其抗血清反應(yīng)均出現(xiàn)明顯的雜交條帶。且具有良好免疫原性;不同膜蛋白提取方法所獲的膜蛋白經(jīng)westernblot分析后其雜交條帶數(shù)量存在差異。(2)6株Mb不同分離株的全菌蛋白和3株Mb不同分離株之間不同膜蛋白提取方法所獲的膜蛋白均明顯出現(xiàn)2條相同的westernblot雜交條帶,分子量