農(nóng)桿菌質(zhì)粒Ti介導(dǎo)的蘚羽藻基因轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、蘚羽藻是一種多核單細(xì)胞海洋綠藻，其原生質(zhì)體可在海水中發(fā)育成為新的個體。因此，如果將表達(dá)質(zhì)粒與其原生質(zhì)體共團(tuán)聚，則有可能獲得攜帶外源基因的蘚羽藻植株。若外源基因整合到蘚羽藻染色體就可能很容易地得到轉(zhuǎn)基因藻體。本研究利用蘚羽藻原生質(zhì)體作為外源基因的受體和表達(dá)系統(tǒng)，以農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因工程中常用的農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒作為載體將外源基因轉(zhuǎn)入海藻，試圖建立了一種可供選擇的藻類基因重組系統(tǒng)。主要研究內(nèi)容如下:
　　1.篩選蘚羽藻原生質(zhì)體團(tuán)聚過程中活躍表達(dá)的

2、基因區(qū)段，作為外源基因插入的潛在位點。我們發(fā)現(xiàn)蘚羽藻中一種凝集素基因在其原生質(zhì)體團(tuán)聚過程中起重要作用，利用熒光定量PCR技術(shù)對其轉(zhuǎn)錄水平，免疫印跡法在蛋白水平上進(jìn)行了檢測，證明其在原生質(zhì)團(tuán)聚及發(fā)育過程中存在一個先增加后降低的過程。免疫膠體金定位試驗結(jié)果說明此凝集素在蘚羽藻細(xì)胞內(nèi)含量豐富，它既存在于胞質(zhì)中，也存在于葉綠體的類囊體膜內(nèi)。推測凝集素能促進(jìn)原生質(zhì)體中細(xì)胞器的團(tuán)聚與再生。
　　2.采用染色體步移技術(shù)獲得了凝集素基因的側(cè)翼序列

3、，并在5'非翻譯區(qū)發(fā)現(xiàn)了一段強(qiáng)啟動子序列。以凝集素基因、GFP檢測基因、凝集素基因3'與5'端各一段非翻譯區(qū)段作為元件，按照不同的排列次序，將這幾種元件組裝入pCAMBIA3301質(zhì)粒，分別構(gòu)建了四種Ti質(zhì)粒p3301SLec5'G3'UTR，p3301SGFP，p3301SGFP5'-3'UTR，p3301SGFP5'S3'UTR，經(jīng)大腸桿菌擴(kuò)增后，分別回收質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌。
　　3.培養(yǎng)包含Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株EHA105和LB

4、A4404至OD600=0.3左右，加入乙酰丁香酮誘導(dǎo)，參考上述蘚羽藻原生質(zhì)團(tuán)聚體形成及發(fā)育過程中凝集素表達(dá)變化的結(jié)果，在原生質(zhì)團(tuán)聚時，加入乙酰丁香酮誘導(dǎo)處理的農(nóng)桿菌，待團(tuán)聚體形成6小時至12小時內(nèi)，每隔1小時，用乙酰丁香酮誘導(dǎo)15分鐘的農(nóng)桿菌處理團(tuán)聚球10分鐘，之后換海水培養(yǎng)原生質(zhì)團(tuán)聚球。待原生質(zhì)體發(fā)育成小苗后，熒光顯微鏡觀察新長出的植株，但未監(jiān)測到綠色熒光蛋白的表達(dá)。后提取DNA，以GFP基因設(shè)計引物，進(jìn)行分子鑒定，可惜的是也沒有監(jiān)