馬鈴薯試管薯形成相關(guān)的光糖同時(shí)響應(yīng)基因及耐熱基因型篩選.pdf

1、隨著植物組織培養(yǎng)技術(shù)的不斷成熟，組織培養(yǎng)條件下通過(guò)控制培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件，可以誘導(dǎo)腋芽形成試管薯(microtuber)。研究表明馬鈴薯試管薯在組織結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)發(fā)育、遺傳穩(wěn)定性等方面與自然狀態(tài)下的塊莖基本相同，這為試管薯在生產(chǎn)和研究上的應(yīng)用提供了最基本的前提。試管薯的形成條件的研究有很多，其中較為明確的結(jié)果是短日照和較高的蔗糖濃度是試管薯形成的必須條件，但關(guān)于光周期與蔗糖的協(xié)同調(diào)控試管薯形成機(jī)制目前還不清楚。馬鈴薯是喜涼作物，溫度是影響

2、馬鈴薯產(chǎn)量最重要的因素之一，高溫會(huì)抑制塊莖的形成，對(duì)于一些熱帶地區(qū)而言，馬鈴薯種植仍然存在許多困難，而馬鈴薯耐熱機(jī)制和遺傳基礎(chǔ)研究的還十分缺乏。
　　基于上述背景本研究主要分為兩大部分內(nèi)容，第一部分在實(shí)驗(yàn)室前期利用RNA-seq技術(shù)分別建立的光周期和蔗糖轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)的基礎(chǔ)上，對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步分析，篩選光-糖協(xié)同作用的差異表達(dá)基因，為深入研究光糖協(xié)同調(diào)控馬鈴薯試管薯形成的分子機(jī)理提供研究基礎(chǔ)。第二部分是利用實(shí)驗(yàn)室試管薯研究平臺(tái)，在前期

3、光周期對(duì)試管薯生長(zhǎng)發(fā)育影響研究的基礎(chǔ)上，先確定耐熱性篩選鑒定的溫度，然后通過(guò)耐熱性鑒定篩選出耐熱性差異基因型，為后期進(jìn)一步分離出耐熱性差異的相關(guān)基因奠定基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下:
　　1.光糖同時(shí)響應(yīng)的相關(guān)基因篩選:首先通過(guò)對(duì)前期利用第一代RNA-seq測(cè)序技術(shù)獲得的光周期處理轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)資料進(jìn)行重分析，在將其與現(xiàn)在的馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)庫(kù)序列比對(duì)的基礎(chǔ)上，使基因標(biāo)簽與現(xiàn)在馬鈴薯的通用基因標(biāo)簽一致。然后按照現(xiàn)在的分析方法重新分析，篩選得到17

4、0個(gè)光周期響應(yīng)的差異表達(dá)基因。其次，利用實(shí)驗(yàn)室前期已有的蔗糖處理轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)資料，采用相同的分析方法得到響應(yīng)蔗糖的差異表達(dá)基因302個(gè)，比對(duì)分析篩選到128個(gè)光糖同時(shí)響應(yīng)基因。
　　2.光糖同時(shí)響應(yīng)的相關(guān)基因的信息分析:對(duì)光周期和蔗糖同時(shí)有響應(yīng)的128個(gè)基因進(jìn)行GO(Gene Ontology)注釋和KEGG pathway路徑分析，發(fā)現(xiàn)基因涉及了37個(gè)功能小類和28條代謝路徑上。其中主要涉及了光合作用、植物病原互作和激素信號(hào)傳

5、導(dǎo)等路徑。
　　3.光糖同時(shí)響應(yīng)的關(guān)鍵基因確定與表達(dá)分析:結(jié)合GO和KEGG pathway注釋，選擇了26個(gè)涉及脅迫應(yīng)答、糖類代謝、發(fā)育、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及若干功能未知基因進(jìn)行進(jìn)一步的分析，選其中的7個(gè)基因?qū)ζ湓诮Y(jié)薯表型顯著差異基因型中的表達(dá)模式進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)有3個(gè)基因?qū)Y(jié)薯響應(yīng)，分別是PGSC0003DMT400007869(Osmotin)PGSC0003DMT400013500(Glucose-6-phosphate/p

6、hosphatetranslocator2)和PGSC0003DMT400073694(Chloroplast-post-illumination-chlorophyll fluorescence increase protein)。
　　4.馬鈴薯高溫處理溫度確定:先以馬鈴薯結(jié)薯季節(jié)可能的較高溫度范圍(26-30℃)為耐熱性篩選溫度設(shè)置范圍，26℃處理不能達(dá)到篩選鑒定耐熱基因型的目的，而30℃高溫處理下的試管苗幾乎都無(wú)法正常生長(zhǎng)

7、，介于其中的28℃培養(yǎng)條件下可以明顯反應(yīng)基因型對(duì)溫度的敏感程度，所以確定以28℃作為篩選鑒定馬鈴薯耐高溫性的實(shí)驗(yàn)溫度。
　　5.馬鈴薯耐熱性差異基因型篩選:為篩選耐熱性差異基因型，用MTI群體材料中的9個(gè)基因型在恒溫(28℃)處理基礎(chǔ)上又做了晝夜變溫（日間28℃夜間25℃）處理，并對(duì)照實(shí)驗(yàn)室對(duì)這些基因型在長(zhǎng)日照和短日照條件下的結(jié)薯習(xí)性評(píng)價(jià)，最終篩選得到光溫雙敏感基因型MTI115和MTI035，光周期不敏感但溫度敏感的基因型MTI