杜氏鹽藻GFP表達載體的構(gòu)建及電轉(zhuǎn)化.pdf

1、本實驗擴增了RR-gfp和gfp片段，并分別與含有鹽藻強啟動子的載體連接，構(gòu)建了2種帶有g(shù)fp報告基因的新型質(zhì)粒表達載體p215t和p115t，質(zhì)粒酶切電泳結(jié)果從分子水平證明載體構(gòu)建成功。質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化EscherichiacoliMC4100A細胞，探討了外源基因gfb在原核宿主中的表達。用p215t和p115t分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌，gfp基因在原核宿主中實現(xiàn)了表達，但熒光蛋白產(chǎn)物在宿主細胞中的分布有所不同。用p215t轉(zhuǎn)化細菌細胞，轉(zhuǎn)化子

2、熒光在細胞周圍形成一個光圈或分布在兩極。在p215t中，gfp基因上游存在RR-信號肽序列，信號肽介導(dǎo)熒光蛋白在細胞內(nèi)發(fā)生了轉(zhuǎn)運。p115t中不存在信號肽序列，熒光均勻分布于轉(zhuǎn)化細胞。 本實驗采用電擊法將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化Dunaliellasalina細胞，對藻齡、電擊緩沖液以及電場強度3種電轉(zhuǎn)參數(shù)分別進行了探討，確定了本實驗條件下的最佳轉(zhuǎn)化條件。實驗證明，選擇藻齡為7d的細胞，電擊緩沖液組分為1.0mmol·L-1HEPES+0.

3、5mol·L-1甘油，電場強度為6kV·cm-1進行轉(zhuǎn)化可獲得本實驗條件下最佳轉(zhuǎn)化效果，載體p215t和p115t的最高轉(zhuǎn)化率分別為1.00‰和1.02‰。 由于缺乏細胞壁，鹽藻細胞對于滲透壓十分敏感。在電擊轉(zhuǎn)化過程中，維持細胞滲透壓是提高轉(zhuǎn)化效率的有效方法。本實驗通過添加甘油改進電擊緩沖液成分，討論了甘油對于提高轉(zhuǎn)化前細胞存活率的作用，同時研究了不同濃度甘油對于鹽藻細胞生長的影響。實驗證明，用含有0.5mol·L-1甘油的HE

4、PES緩沖液處理轉(zhuǎn)化前細胞可獲得最高存活率，約86％。當(dāng)甘油被添加到鹽藻培養(yǎng)基時，實驗發(fā)現(xiàn)低濃度甘油能夠促進細胞恢復(fù)生長，高濃度甘油對于細胞生長具有毒害作用；培養(yǎng)基中含有5mmol·L-1甘油對于維持細胞生活力、促進總生物量的積累具有最佳效果。電擊轉(zhuǎn)化效果和甘油生理實驗均表明，0.5mol·L-1甘油可作為鹽藻電擊轉(zhuǎn)化過程中一種良好的穩(wěn)滲劑。 用質(zhì)粒載體p215t和p115t分別轉(zhuǎn)化杜氏鹽藻細胞，報告基因gfp均能成功在藻細胞中