杜氏鹽藻CCAP19-18葉綠體轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化.pdf

1、近年來(lái),藻類作為一種新的生物反應(yīng)器得到重視,相對(duì)于已有的大腸桿菌、酵母、轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物系統(tǒng)而言,具有生長(zhǎng)迅速、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、易于遺傳操作、成本低廉等特點(diǎn),受到了人們的青睞。其中鹽藻是迄今已知最耐鹽的單細(xì)胞真核綠藻,可在0.05-5.5M NaCl中生長(zhǎng),是適合大規(guī)模開(kāi)放式培養(yǎng)的理想微藻。
　　 目前,模式生物衣藻的轉(zhuǎn)基因研究已趨于成熟,作為衣藻的近緣藻,鹽藻的轉(zhuǎn)基因研究也在逐步進(jìn)展,已有多種蛋白在鹽藻核系統(tǒng)中表達(dá)。隨著核轉(zhuǎn)化系統(tǒng)研究不

2、斷深入,也發(fā)現(xiàn)了一些至今尚未解決的難題:表達(dá)量低、基因組大且背景復(fù)雜、外源基因轉(zhuǎn)入后易出現(xiàn)失活、沉默和位置效應(yīng)、在其內(nèi)表達(dá)原核基因必先經(jīng)修飾改造、環(huán)境安全問(wèn)題等易發(fā)生。葉綠體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)因其定點(diǎn)整合,可人為控制其插入位點(diǎn),從而很好地解決了核轉(zhuǎn)化后“基因失活”、“位置效應(yīng)”等問(wèn)題。而葉綠體DNA分子的多拷貝及多順?lè)醋拥谋磉_(dá)形式,可使外源基因由共同的啟動(dòng)子控制,不僅操作簡(jiǎn)便而且避免了“共沉默”現(xiàn)象,還對(duì)外源性表達(dá)產(chǎn)物的積累擁有較高的耐受能力,為

3、外源基因的在其系統(tǒng)的高效表達(dá)提供了保障。其母系遺傳的特點(diǎn)也使其具有較高的生物安全性,因此葉綠體轉(zhuǎn)化成為鹽藻轉(zhuǎn)化的一個(gè)重要方向。葉綠體轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵是構(gòu)建能夠定點(diǎn)整合的表達(dá)載體,必須有適宜的同源序列和插入位點(diǎn)。杜氏鹽藻CCAP19/18的葉綠體基因全序列已測(cè)定完畢(Genbank號(hào):GQ250046.1,全長(zhǎng)269044bp),為建立鹽藻的葉綠體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)提供了極大的便利。本文選取ch1N基因作為同源片段,將外源基因插入其內(nèi)。ch1N基因與ch

4、1B、ch1L一起編碼光非依賴的原葉綠素酸酯還原酶,任一破壞均可阻斷葉綠素在黑暗條件的合成,但藻類可通過(guò)光依賴的原葉綠素酸酯還原酶合成葉綠素,不影響其生存。
　　 本文通過(guò)密度梯度離心法分離杜氏鹽藻完整葉綠體,提取葉綠體DNA,作為模板,設(shè)計(jì)引物采用PCR法擴(kuò)增獲得了ch1N目的片段1622bp。以ch1N基因片段為同源片段,以aptA基因的啟動(dòng)子和rbcL基因的終止子為調(diào)控元件,以氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(cat)為篩選標(biāo)記,構(gòu)建

5、了杜氏鹽藻葉綠體表達(dá)載體pch1N1622-CAT,在25μF、0.8 kV條件下通過(guò)電擊法轉(zhuǎn)入野生型杜氏鹽藻中。為實(shí)現(xiàn)葉綠體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化,必須有適宜的選擇壓力,有效地殺死未轉(zhuǎn)入外源基因和未有效整合的藻株,并使轉(zhuǎn)入整合的外源基因順利地實(shí)現(xiàn)同質(zhì)化。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)杜氏鹽藻CCAP19/18,對(duì)各類常用抗生素的敏感性進(jìn)行了篩選,并對(duì)其敏感的氯霉素進(jìn)行了粗篩和細(xì)選,最終確定CCAP19/18葉綠體轉(zhuǎn)化的氯霉素選擇濃度為300μg/ml。結(jié)果表明：通過(guò)