鹽生杜氏藻MAPK基因的克隆及對煙草的轉(zhuǎn)化.pdf

1、促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases，MAPK)屬于絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶，存在于所有真核生物中，通過對絲氨酸/蘇氨酸的磷酸化修飾將上游信號傳遞至下游，對細(xì)胞周期的運行和基因表達(dá)具有重要調(diào)控作用。近年來，越來越多的實驗研究表明：MAPK在植物生長發(fā)育調(diào)節(jié)和抗逆等生理過程中起重要作用。而現(xiàn)今逆境脅迫嚴(yán)重影響植物的生長，因此提高植物抗逆性的研究有著極為重要的現(xiàn)實意義。本實驗利

2、用傳統(tǒng)的同源克隆方法成功克隆到鹽生杜氏藻MAPK基因，并構(gòu)建了植物表達(dá)載體pBI121-MAPK，將其轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105中，然后通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)將其導(dǎo)入煙草中，并對轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行檢測，借以初步探討MAPK基因在煙草中的轉(zhuǎn)化情況，為今后在更多牧草上應(yīng)用提供了依據(jù)。本實驗內(nèi)容和結(jié)果如下： 1.鹽生杜氏藻MAPK基因的克隆利用同源克隆的技術(shù)，從鹽生杜氏藻中克隆到一條MAPK基因的cDNA片段(297bp)，然后以該片段為基礎(chǔ)，利

3、用RACE技術(shù)構(gòu)建其全長序列。 2.植物表達(dá)載體pBI121-MAPK的構(gòu)建利用DNA重組技術(shù)，構(gòu)建植物表達(dá)載體pBI121-MAPK，然后將其通過凍融法導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105中。 3.煙草再生體系的建立采用煙草葉片為外植體，以MS0為基本培養(yǎng)基，篩選出MS0+6-BA(2mg/L)+NAA(0.1mg/L)以誘導(dǎo)不定芽的分化，并于MS0+NAA(0.2mg/L)生根培養(yǎng)基上生根，獲得完整的再生植株。其葉片分化率達(dá)5

4、2.4﹪，生根率達(dá)88.5﹪。 4.轉(zhuǎn)化體篩選及植株再生將預(yù)培養(yǎng)2d的煙草葉片用農(nóng)桿菌菌液浸染10min，共培養(yǎng)2d，然后轉(zhuǎn)化到含Km50mg/L的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行分化篩選，再轉(zhuǎn)入Km為50mg/L、75mg/L的培養(yǎng)基上進(jìn)行生根篩選，生根率達(dá)64.8﹪，獲得轉(zhuǎn)基因植株。 5.轉(zhuǎn)基因煙草分子生物學(xué)檢測對轉(zhuǎn)基因煙草苗的PCR檢測結(jié)果顯示，有17.6﹪的再生苗為陽性，測序結(jié)果正確，說明pBI121-MAPK已經(jīng)整合到煙草基因