鹽生杜氏藻MAPK基因的克隆及對煙草的轉化.pdf

1、促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases，MAPK)屬于絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶，存在于所有真核生物中，通過對絲氨酸/蘇氨酸的磷酸化修飾將上游信號傳遞至下游，對細胞周期的運行和基因表達具有重要調控作用。近年來，越來越多的實驗研究表明：MAPK在植物生長發(fā)育調節(jié)和抗逆等生理過程中起重要作用。而現(xiàn)今逆境脅迫嚴重影響植物的生長，因此提高植物抗逆性的研究有著極為重要的現(xiàn)實意義。本實驗利

2、用傳統(tǒng)的同源克隆方法成功克隆到鹽生杜氏藻MAPK基因，并構建了植物表達載體pBI121-MAPK，將其轉入根癌農桿菌EHA105中，然后通過農桿菌介導將其導入煙草中，并對轉基因煙草進行檢測，借以初步探討MAPK基因在煙草中的轉化情況，為今后在更多牧草上應用提供了依據(jù)。本實驗內容和結果如下： 1.鹽生杜氏藻MAPK基因的克隆利用同源克隆的技術，從鹽生杜氏藻中克隆到一條MAPK基因的cDNA片段(297bp)，然后以該片段為基礎，利

3、用RACE技術構建其全長序列。 2.植物表達載體pBI121-MAPK的構建利用DNA重組技術，構建植物表達載體pBI121-MAPK，然后將其通過凍融法導入根癌農桿菌EHA105中。 3.煙草再生體系的建立采用煙草葉片為外植體，以MS0為基本培養(yǎng)基，篩選出MS0+6-BA(2mg/L)+NAA(0.1mg/L)以誘導不定芽的分化，并于MS0+NAA(0.2mg/L)生根培養(yǎng)基上生根，獲得完整的再生植株。其葉片分化率達5

4、2.4﹪，生根率達88.5﹪。 4.轉化體篩選及植株再生將預培養(yǎng)2d的煙草葉片用農桿菌菌液浸染10min，共培養(yǎng)2d，然后轉化到含Km50mg/L的選擇培養(yǎng)基上進行分化篩選，再轉入Km為50mg/L、75mg/L的培養(yǎng)基上進行生根篩選，生根率達64.8﹪，獲得轉基因植株。 5.轉基因煙草分子生物學檢測對轉基因煙草苗的PCR檢測結果顯示，有17.6﹪的再生苗為陽性，測序結果正確，說明pBI121-MAPK已經整合到煙草基因