以EDC-NHS為交聯(lián)劑的絲素蛋白基大孔微載體的制備與研究.pdf

1、研究背景:急慢性肝衰治療是目前臨床醫(yī)學(xué)急待解決的重大課題之一,每年約有近30萬(wàn)患者死于此癥。盡管內(nèi)科治療已取得長(zhǎng)足的進(jìn)步,但仍只有不到30％的患者能夠存活。肝移植技術(shù)是目前治療肝衰最有效的辦法,但由于供肝缺乏,其發(fā)展受到極大的制約。而肝臟組織工程為肝病的終末期治療帶來(lái)了新的希望。肝組織工程作為構(gòu)建可植入肝的創(chuàng)新方法,具有緩解器官供體短缺的潛能。組織工程學(xué)是20世紀(jì)80年代末發(fā)展起來(lái)的一門新興交叉學(xué)科,組織工程的基本含義是應(yīng)用工程學(xué)和生命

2、科學(xué)的基本原理和技術(shù),在體外構(gòu)建具有生物功能的人工取代物,用于修復(fù)組織缺損,替代失去功能或衰竭的組織、器官的部分或全部功能。近年來(lái),隨著生命科學(xué)、材料科學(xué)和工程科學(xué)的發(fā)展,科研人員相繼在多種組織、器官體外再造的研究方面取得突破性進(jìn)展,其中,一些組織工程產(chǎn)品如軟骨、皮膚已實(shí)現(xiàn)商品化。其核心是建立細(xì)胞與生物材料的三維空間復(fù)合體,即具有生命力的活體組織,用以對(duì)病損組織進(jìn)行形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的重建并達(dá)到永久性替代。主要研究?jī)?nèi)容包括種子細(xì)胞的選取,

3、細(xì)胞外基質(zhì)材料(即支架材料)以及組織和器官的構(gòu)建與再生。肝細(xì)胞是具有極性的錨定依賴性細(xì)胞,需要一種不溶的細(xì)胞外基質(zhì)才能獲得生存、重組、增殖并發(fā)揮功能,支架材料的生物相容性和細(xì)胞黏附能力是至關(guān)重要的。近幾年來(lái),人們逐漸認(rèn)識(shí)到基質(zhì)材料在其中占有重要地位,基質(zhì)材料既是信號(hào)分子或細(xì)胞的載體,又是新生組織生長(zhǎng)的支架。理想的支架材料應(yīng)具有以下特性:三維多孔的連接網(wǎng)絡(luò),有利于細(xì)胞生長(zhǎng)、養(yǎng)分傳輸和代謝產(chǎn)物的排放；生物相容性和可降解性好,降解速度和吸收速

4、度可以調(diào)控,以適應(yīng)細(xì)胞或組織在體內(nèi)和體外的生長(zhǎng)；化學(xué)表面適合細(xì)胞的黏附、增殖和分化；機(jī)械性能與所植入的組織的要求相匹配。因此,尋找適宜的基質(zhì)材料,是組織工程研究中的一個(gè)重要內(nèi)容。近年來(lái)微載體在生物人工肝及組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用研究正日趨升溫,主要是利用微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行種子細(xì)胞的擴(kuò)增和用來(lái)充當(dāng)體內(nèi)細(xì)胞治療的傳輸載體。相比于實(shí)心微載體,大孔微載體的優(yōu)勢(shì)在于為細(xì)胞提供了足夠的生長(zhǎng)空間和更大的附著面積,有利于營(yíng)養(yǎng)成分的進(jìn)入和代謝產(chǎn)物的排出,提

5、高了細(xì)胞培養(yǎng)密度和代謝活性。隨著對(duì)組織工程支架材料研究的深入,研究人員發(fā)現(xiàn)對(duì)高分子材料進(jìn)行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)改性、表面修飾等處理可誘導(dǎo)和提高肝細(xì)胞在支架材料上的黏附和增殖行為。在肝組織工程支架方面,以半乳糖基修飾各種天然的和人工聚合物,通過(guò)肝細(xì)胞表面去唾液酸糖蛋白受體和聚合物鏈上高濃度的半乳糖基之間獨(dú)特的分子識(shí)別功能,可以提高肝細(xì)胞的特異功能。半乳糖基是肝細(xì)胞表面去唾液酸糖蛋白受體(asialoglycoprotein receptor,ASG

6、PR)的特異性配體,是肝細(xì)胞識(shí)別的相應(yīng)位點(diǎn)并能產(chǎn)生特異性相互作用。在肝組織工程細(xì)胞外基質(zhì)支架材料上引入半乳糖基,可誘導(dǎo)和提高肝細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)支架材料上的黏附和增殖行為。本課題組的前期研究中已成功地以絲素蛋白、殼聚糖、乳糖酸等為原料,首先在殼聚糖上接枝半乳糖基,然后將絲素蛋白(Silk Fibroin)與半乳糖基化殼聚糖(Galactosylated Chitosan)復(fù)合,將半乳糖基引入材料中,制備出了一種具有肝細(xì)胞特異性的高性能的大

7、孔微載體。目前肝組織工程大多采用復(fù)合材料作為支架材料,通過(guò)化學(xué)交聯(lián)的方法一般能獲得理想的、均勻一致的交聯(lián)強(qiáng)度,但交聯(lián)劑的選擇非常關(guān)鍵。戊二醛是最常用的交聯(lián)氨基酸交聯(lián)劑,但戊二醛殘留質(zhì)量濃度在低至3.0 mg/L時(shí)仍有毒性。水溶性1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(C8H17N3·HCl,EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(C4H5NO3,NHS)是一種新型無(wú)毒、生物相容性良好的交聯(lián)劑,可促發(fā)膠原發(fā)生交聯(lián),形成酰胺鍵。交聯(lián)過(guò)程中ED

8、C、NHS不進(jìn)入最終產(chǎn)物中,而是轉(zhuǎn)變成水溶性的脲衍生物,因此細(xì)胞毒性很小,以之作為交聯(lián)劑制備肝組織工程的支架材料有望在生物相容性及提高肝細(xì)胞功能方面得到優(yōu)化。
　　 目的:以絲素蛋白、殼聚糖、乳糖酸等為原料,以完全無(wú)毒的EDC/NHS為交聯(lián)劑,將絲素蛋白(Silk Fibroin)與半乳糖基化殼聚糖(Galactosylated Chitosan)復(fù)合交聯(lián),制備出一種生物相容性良好并具有肝細(xì)胞特異性的高性能的大孔微載體。并通過(guò)M

9、TT測(cè)試及細(xì)胞功能測(cè)試等研究該新型大孔微載體的生物相容性。
　　 方法:首先通過(guò)查閱文獻(xiàn)初步確定以EDC/NHS交聯(lián)絲素與殼聚糖的初步劑量,并通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)初步將交聯(lián)劑量分為高、中、低三個(gè)組。然后制備出絲素蛋白水溶液和半乳糖基化殼聚糖溶液。將絲素蛋白水溶液與GC溶液按照一定比例混合后隨機(jī)分成三組,分別加入高、中低三種劑量交聯(lián)劑,再通過(guò)乳化-化學(xué)交聯(lián)、極性溶液處理、冷凍干燥后得到低、中、高三組交聯(lián)劑劑量的SF/GC大孔微載體。分別測(cè)定

10、三組微載體的直徑及孔徑大小、密度及吸水率并通過(guò)倒置顯微鏡及電鏡等觀察微載體形態(tài)。再將EDC/NHS作為交聯(lián)劑制備出的SF/GC大孔微載體作為實(shí)驗(yàn)組,以戊二醛為交聯(lián)劑制備出的SF/GC大孔微載體作為對(duì)照組,分別運(yùn)用MTT法比較其生物毒性。將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組分別于永生化肝細(xì)胞系C3A細(xì)胞共培養(yǎng)比較其共培養(yǎng)后的細(xì)胞功能,所得數(shù)據(jù)均運(yùn)用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析,P<0.05有意義。
　　 結(jié)果:本課題以生物相容性良好的天然高分子材料絲

11、素蛋白、殼聚糖為原料,在首先成功地在殼聚糖上接枝了半乳糖基。然后以EDC/NHS為交聯(lián)劑將SF與GC復(fù)合,應(yīng)用乳化-化學(xué)交聯(lián)、極性溶液處理、冷凍干燥等方法制備出了一種肝細(xì)胞特異性SF/GC大孔微載體。通過(guò)比較不同的交聯(lián)劑劑量后發(fā)現(xiàn)當(dāng)交聯(lián)劑劑量為EDC:0.6g、NHS:0.14g時(shí)微載體的直徑為200-400μm,孔徑為40-80μm,密度為1.03-1.08g/ml,最適合肝細(xì)胞生長(zhǎng)。通過(guò)掃描電子顯微鏡(SEM)觀察該大孔微載體表面呈

12、多孔結(jié)構(gòu),開口向外,呈喇叭狀,孔的分布均勻,內(nèi)部亦為多孔結(jié)構(gòu),適合于肝細(xì)胞旋轉(zhuǎn)微重力培養(yǎng)及攪拌培養(yǎng)。通過(guò)分別比較實(shí)驗(yàn)組SF/GC大孔微載體和以對(duì)照組SF/GC大孔微載體的MTT測(cè)試后發(fā)現(xiàn),三個(gè)實(shí)驗(yàn)組大孔微載體的細(xì)胞活力存在顯著差異(F=312.920,P<0.001)。根據(jù)OD值變化曲線可以看出實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞活力顯著高于對(duì)照組而與空白對(duì)照組則無(wú)顯著差異。通過(guò)比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組微載體與C3A細(xì)胞共培養(yǎng)后的細(xì)胞功能結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組微載體的葡萄糖

13、消耗濃度顯著的高于對(duì)照組(F=96.915,P<0.001),而白蛋白的分泌量則無(wú)顯著差異。實(shí)驗(yàn)組微載體與C3A細(xì)胞共培養(yǎng)后隨共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng) ALT(F=61.375,P<0.001)與AST(F=13.962,P=0.001)的漏出量均顯著低于對(duì)照組。
　　 結(jié)論
　　 (1)以絲素蛋白、殼聚糖為原料,通過(guò)對(duì)殼聚糖進(jìn)行半乳糖基化修飾,然后以完全無(wú)毒的EDC/NHS為交聯(lián)劑將SF與GC復(fù)合,應(yīng)用乳化-化學(xué)交聯(lián)、極性溶液

14、處理、冷凍干燥等方法可制備出生物相容性良好并具有肝細(xì)胞特異性親和力的SF/GC大孔微載體；
　　 (2)當(dāng)交聯(lián)劑劑量為EDC:0.6g、NHS:0.14g時(shí)制備出的微載體直徑為200-400μm,孔徑為40-80μm,密度為1.03—1.08g/ml,最適合肝細(xì)胞生長(zhǎng)。通過(guò)掃描電子顯微鏡(SEM)觀察該大孔微載體表面呈多孔結(jié)構(gòu),,開口向外,呈喇叭狀,孔的分布均勻,內(nèi)部亦為多孔結(jié)構(gòu),適合于肝細(xì)胞高密度培養(yǎng)。最適合肝細(xì)胞生長(zhǎng)。