肝細胞特異性絲素蛋白基大孔微載體的制備與研究.pdf

1、隨著對肝衰竭病理生理認識的不斷深入，人們認識到對肝功能衰竭的體外支持不僅要清除毒素，而且還需要提供更全面的肝臟功能支持，包括替代肝臟的解毒，合成，轉(zhuǎn)化及分泌等功能。生物型人工肝和組合型人工肝就是基于上述理論設(shè)計的，生物型人工肝是20世紀80年代后期發(fā)展起來的體外人工肝支持系統(tǒng)。所謂生物型人工肝是指在組成中含有活的生物成分如活的器官，組織或細胞的人工肝支持系統(tǒng)。其核心部分生物反應(yīng)器是由肝細胞與生物合成材料組合而成；如何建立具有質(zhì)量高、細胞

2、數(shù)量足、安全性強的生物反應(yīng)器培養(yǎng)系統(tǒng)是目前生物型人工肝研究領(lǐng)域最重要、也是最困難的核心技術(shù)問題。肝細胞是具有極性的錨定依賴性細胞，需要一種不溶的細胞外基質(zhì)才能獲得生存、重組、增殖并發(fā)揮功能，支架材料的生物相容性和細胞黏附能力是至關(guān)重要的。近幾年來，人們逐漸認識到基質(zhì)材料在組織工程中占有重要地位，基質(zhì)材料既是信號分子或細胞的載體，又是新生組織生長的支架。因此，尋找適宜的基質(zhì)材料，研究其與組織和細胞的相互作用，探索信號分子、細胞與載體的組裝

3、模式，是組織工程研究中的一個重要內(nèi)容。近年來微載體在組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用研究正日趨升溫，主要是利用微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)進行組織工程種子細胞的擴增和用來充當(dāng)體內(nèi)細胞治療的傳輸載體。相比于實心微載體，大孔微載體的優(yōu)勢在于為細胞提供了足夠的生長空間和更大的附著面積，有利于營養(yǎng)成分的進入和代謝產(chǎn)物的排出，提高了細胞培養(yǎng)密度和代謝活性。隨著對組織工程支架材料研究的深入，研究人員發(fā)現(xiàn)對高分子材料進行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)改性、表面修飾等處理可誘導(dǎo)和提高肝細胞在支架

4、材料上的黏附和增殖行為。在肝組織工程支架方面，以半乳糖基修飾各種天然的和人工聚合物，通過肝細胞表面去唾液酸糖蛋白受體和聚合物鏈上高濃度的半乳糖基之間獨特的分子識別功能，可以提高肝細胞的特異功能。半乳糖基是肝細胞表面去唾液酸糖蛋白受體（asialoglycoprotein receptor，ASGPR）的特異性配體，是肝細胞識別的相應(yīng)位點并能產(chǎn)生特異性相互作用。在肝組織工程細胞外基質(zhì)支架材料上引入半乳糖基，可誘導(dǎo)和提高肝細胞在細胞外基質(zhì)支

5、架材料上的黏附和增殖行為。 目的: 以絲素蛋白、殼聚糖、乳糖酸等為原料，首先在殼聚糖上接枝半乳糖基，然后將絲素蛋白（Silk Fibroin）與半乳糖基化殼聚糖（Galactosylated Chitosan）復(fù)合，將肝細胞表面去唾液酸糖蛋白受體（asialoglycoprotein receptor，ASGPR）的特異性配體——半乳糖基引入材料中，制備出一種具有肝細胞特異性的高性能的大孔微載體。 方法:

6、 首先在EDC和NHS的活化作用下在殼聚糖上接枝半乳糖基；然后將絲素蛋白（SF）和半乳糖基化殼聚糖（GC）按照一定比例混合，綜合應(yīng)用乳化-化學(xué)交聯(lián)、極性溶液處理、冷凍干燥等方法制備出一種具有多孔結(jié)構(gòu)的肝細胞特異性SF/GC大孔微載體。并初步測定了SF/GC大孔微載體吸水率及密度；利用倒置顯微鏡、掃描電鏡等觀察大孔微載體的形貌；對半乳糖基化殼聚糖進行1HNMR譜表征；利用FITR譜對SF/CS、SF/GC大孔微載體材料的化學(xué)結(jié)構(gòu)進行了表征

7、；通過將人肝細胞系CL-1細胞與SF/GC大孔微載體共培養(yǎng)，評價SF/GC大孔微載體與肝細胞的生物相容性；并對SF/GC大孔微載體的消毒方法進行了初步探討，利用高壓蒸汽滅菌法對SF/GC大孔微載體進行滅菌，并從滅菌前后大孔微載體的形態(tài)變化、細胞培養(yǎng)結(jié)果、化學(xué)結(jié)構(gòu)是否改變等方面探討高溫高壓滅菌法對SF/GC大孔微載體的影響。 結(jié)果: 本課題以生物相容性良好的天然高分子材料絲素蛋白、殼聚糖為原料，在EDC和NHS的活化作用下

8、成功地在殼聚糖上接枝了半乳糖基。通過將SF與GC復(fù)合，應(yīng)用乳化-化學(xué)交聯(lián)、極性溶液處理、冷凍干燥等方法制備出了一種肝細胞特異性SF/GC大孔微載體。掃描電子顯微鏡（SEM）觀察該大孔微載體表面呈多孔結(jié)構(gòu)，孔徑為40-80μm，開口向外，呈喇叭狀，孔的分布均勻，內(nèi)部亦為多孔結(jié)構(gòu)，適合于肝細胞高密度培養(yǎng)。并通過1HNMR譜、FITR譜表征，證實半乳糖基已經(jīng)成功復(fù)合到支架材料之中。該支架材料中引入了肝細胞表面去唾液酸糖蛋白受體（ASGPR）的

9、特異性配體——半乳糖基，半乳糖基是肝細胞識別的相應(yīng)位點并能產(chǎn)生特異性相互作用，可誘導(dǎo)和提高肝細胞在細胞外基質(zhì)支架材料上的黏附和增殖行為；從而具有肝細胞親和性，有助于細胞黏附、增殖，支持大量細胞生長，并能長期維持細胞活性和細胞功能。初步的細胞實驗表明肝細胞能與材料特異性黏附、細胞圍繞微載體聚集生長，并表現(xiàn)出很好的活力。將SF/GC大孔微載體與CL-1細胞在RCCS生物反應(yīng)器中共培養(yǎng)時，肝細胞呈多細胞聚集的團塊，由于肝細胞表面ASGPR和支

10、架上半乳糖基之間的分子識別功能，細胞附著牢固，且肝細胞能夠進入孔中生長，適合于肝細胞高密度培養(yǎng)。通過對SF/GC大孔微載體的消毒方法的探討，證實了本課題制備出的SF/GC大孔微載體通過傳統(tǒng)的高壓蒸汽滅菌后，材料的主要性能沒有改變。 結(jié)論: （1）以絲素蛋白、殼聚糖為原料，通過對殼聚糖進行半乳糖基化修飾，然后將SF與GC復(fù)合，應(yīng)用乳化-化學(xué)交聯(lián)、極性溶液處理、冷凍干燥等方法可制備出具有肝細胞特異性親和力的SF/GC大孔微載

11、體；（2）由于肝細胞表面ASGPR和SF/GC大孔微載體上半乳糖基之間的分子識別功能，可誘導(dǎo)和提高肝細胞在SF/GC大孔微載體支架材料上的黏附和增殖行為，因而具有肝細胞特異性；（3）本課題制備出的SF/GC大孔微載體可應(yīng)用傳統(tǒng)的高壓蒸汽滅菌法進行滅菌。本課題研究制備出的SF/GC大孔微載體具有肝細胞親和性，有助于細胞黏附、增殖、長期維持細胞活性和功能，將會在肝組織工程，特別是生物人工肝的研究領(lǐng)域發(fā)揮積極的作用。隨著對材料-細胞相互作用研