骨骼間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用.pdf

1、潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)屬炎癥性腸病(inflammatorybowel disease,IBD),呈慢性、反復(fù)發(fā)作性。近年來(lái),UC發(fā)病率呈逐漸增長(zhǎng)的趨勢(shì),目前對(duì)UC的治療尚無(wú)特異、有效且無(wú)毒副作用的藥物,因此,迫切需要探索新的、有效的治療手段。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有高度自我更新能力,可向三個(gè)胚層的細(xì)胞分化,在干細(xì)胞移植治療和組織工程等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用

2、前景。目前已有MSCs治療IBD的報(bào)道,但其在腸道的分化及治療機(jī)制仍不十分明確。本實(shí)驗(yàn)擬分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增大鼠骨髓MSCs,DAPI標(biāo)記后經(jīng)靜脈移植入U(xiǎn)C模型大鼠,觀察MSCs對(duì)UC的治療效果,并探討其可能的機(jī)制。
　　 第一部分、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定
　　 1材料與方法
　　 1.1 取3-4周SD大鼠的股骨、脛骨骨髓,貼壁法分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增MSCs。鏡下觀察原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)情況。

3、流式細(xì)胞儀檢測(cè)第3代MSCs(P3-MSCs)表達(dá)CD29、CD90和CD45的情況。
　　 1.2 取P3-MSCs,分別進(jìn)行成骨誘導(dǎo)和成脂誘導(dǎo)。
　　 2.結(jié)果：
　　 2.1 MSCs原代培養(yǎng)后3～12h后即見(jiàn)部分細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。培養(yǎng)3～12d,細(xì)胞數(shù)量迅速增多,多呈梭形及漩渦狀排列。傳代后MSCs生長(zhǎng)快于原代細(xì)胞。P3-MSCs生長(zhǎng)滯留期約為24～48h,對(duì)數(shù)增殖期約為3～6d,7～8d后進(jìn)入平臺(tái)期,6代后

4、細(xì)胞出現(xiàn)衰老征象。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示:P3-MSCs表面標(biāo)記物CD29、CD90陽(yáng)性,CD45陰性。CD29、CD90均一性分別為99.82±0.11％、99.84±0.25%。
　　 2.2 MSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)后,細(xì)胞變?yōu)槎嘟切位虿灰?guī)則形,Von Kossa染色后有鈣化結(jié)節(jié)形成;對(duì)照組仍為長(zhǎng)梭形,未見(jiàn)鈣化結(jié)節(jié)形成。MSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)后,細(xì)胞變?yōu)閳A形或橢圓形,胞質(zhì)充滿脂滴,油紅O染色脂滴呈橘紅色;對(duì)照組細(xì)胞仍為長(zhǎng)梭形,無(wú)脂滴

5、出現(xiàn)。
　　 第二部分、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療大鼠潰瘍性結(jié)腸炎
　　 1 材料與方法
　　 1.1 DAPI標(biāo)記P3-MSCs備用。
　　 1.2 SD大鼠45只隨機(jī)分為移植組、PBS組和正常對(duì)照組。移植組和PBS組用免疫復(fù)合法制備UC模型。建模后24h,三組大鼠均經(jīng)尾靜脈注射1mL液體:移植組為DAPI標(biāo)記的P3-MSCs(3×106)懸液,PBS組及正常對(duì)照組為PBS。
　　 1.3 每天觀

6、察動(dòng)物的癥狀和體征。移植后3d、7d、14d,3組各處死5只,解剖觀察結(jié)腸病變,并制備HE染色石蠟切片,光鏡下觀察結(jié)腸組織病理變化。
　　 1.4 各時(shí)間點(diǎn)取移植組結(jié)腸組織,制備冰凍組織切片。熒光顯微鏡下觀察移植的MSCs在結(jié)腸的分布,每組切片在隨機(jī)10個(gè)高倍(×200)視野下計(jì)數(shù)DAPI標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)目:免疫熒光染色后激光共聚焦顯微鏡下觀察移植的MSCs細(xì)胞角蛋白(cytokeratin,CK)的表達(dá)。
　　 2.結(jié)果：

7、
　　 2.1 DAPI標(biāo)記后的MSCs細(xì)胞核發(fā)明亮藍(lán)色熒光,標(biāo)記后14d仍有約90%的細(xì)胞可觀察到熒光。
　　 2.2 移植MSCs后,移植組大鼠癥狀明顯改善。結(jié)腸組織石蠟切片顯示移植后7d、14d移植組結(jié)腸病變的修復(fù)均明顯優(yōu)于。PBS組。
　　 2.3 各時(shí)間點(diǎn)移植組均見(jiàn)DAPI標(biāo)記的MSCs,主要分布于黏膜層和黏膜下層,肌層和外膜層偶見(jiàn),且潰瘍周邊黏膜層的分布略多于正常部位。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,移植細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間增

8、多,至14d時(shí)最多(P＜0.05)。移植后7d、14d,移植組結(jié)腸組織可見(jiàn)少量DAPI標(biāo)記細(xì)胞表達(dá)CK。
　　 全文結(jié)論：
　　 1.用貼壁篩選法,成功分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增大鼠骨髓MSCs。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示培養(yǎng)的P3-MSCs具有MSCs的表型特征。
　　 2.P3-MSCs在體外可誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞,證明所分離的MSCs具有多向分化的能力。
　　 3.經(jīng)尾靜脈移植骨髓MSCs對(duì)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎有