臍帶源間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)慢性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎相關(guān)肝膽病變的治療作用.pdf

1、潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種病因不明的腸道炎癥性疾病，是我國炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)的主要臨床形式之一。IBD患者常伴發(fā)一些腸外表現(xiàn)(extraintestinal manifestations，EIMs)，肝膽病變是IBD常見的EIMs。據(jù)統(tǒng)計(jì)，肝膽病變是影響IBD病死率的重要因素之一。因此，研究IBD發(fā)病中相關(guān)的肝膽病變及其機(jī)制，對(duì)IBD的綜合治療

2、具有重要意義。
　　眾所周知，正常機(jī)體腸腔內(nèi)含有大量細(xì)菌及內(nèi)毒素，而IBD發(fā)病時(shí)因受損結(jié)腸黏膜的通透性升高，引起細(xì)菌和內(nèi)毒素移位，繼而導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥。內(nèi)毒素的本質(zhì)是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁上的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)成分，細(xì)菌裂解或粘附在其他細(xì)胞上時(shí)LPS釋放出來。肝臟是清除腸源性細(xì)菌及內(nèi)毒素的重要場(chǎng)所，越來越多的證據(jù)表明，LPS/Toll樣受體4(Toll like receptor4，ILR4)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

3、通路在多種慢性肝病的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。
　　TLR是天然免疫系統(tǒng)中識(shí)別病原微生物的主要受體，其中，TLR4在人體的固有免疫和適應(yīng)性免疫中發(fā)揮重要作用。TLR4是將L2S信號(hào)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的表面受體，LPS是肝臟巨噬細(xì)胞(Kupffer細(xì)胞，KC)強(qiáng)的激活劑，KC被LPS激活后可以啟動(dòng)LPS/TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、干擾素-γ(interferon-γ，

4、IFN-γ)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)以及白介素-17A(interleukin-17A，IL-17A)等炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生從而引起肝膽病變。
　　間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一類具有自我更新能力和多向分化潛能的干細(xì)胞，可通過增強(qiáng)腸道上皮修復(fù)能力、減輕腸道炎癥反應(yīng)治療IBD，對(duì)多種原因引起的肝損傷也具有顯著緩解作用。鑒于上述機(jī)制，我們推斷MSCs對(duì)IBD相

5、關(guān)肝膽病變也有治療作用。為此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)人臍帶來源的MSCs(human umbilical cord MSCs，hUC-MSCs)移植治療慢性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎相關(guān)肝膽病變的作用及可能機(jī)制進(jìn)行了初步研究。
　　目的：觀察MSCs對(duì)慢性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸黏膜炎癥及相關(guān)肝膽病變的治療作用與機(jī)制。
　　方法：①慢性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型通過飲用2％右旋葡聚糖硫酸鈉(Dextran sodium sulfate，DSS)成功建立，1～5天、8

6、～12天、15～19天、22～26天、29～33天和36～40天飲用2％的DSS，41、42天及其它時(shí)間飲用蒸餾水。隨機(jī)分為正常對(duì)照組、DSS+Vehicle組、DSS+MSCs組，每組10只；DSS+MSCs組在造模第14天時(shí)經(jīng)尾靜脈注射1×106/200μL的hUC-MSCs，正常對(duì)照組與DSS+Vehicle組則給予等體積PBS作為對(duì)照。第43天處死動(dòng)物。②結(jié)腸黏膜炎癥改變的評(píng)估包括每天體重(Bodyweight，BW)改變、疾病

7、活動(dòng)指數(shù)(Disease activity index，DAI)、結(jié)腸長度等指標(biāo)以及結(jié)腸大體形態(tài)學(xué)改變和組織病理學(xué)評(píng)分。③采用Haematoxylin&eosin staining(H&E染色)、Masson’s trichrome staining(MT染色)方法觀察肝臟病理學(xué)改變。④自動(dòng)生化儀檢測(cè)小鼠肝功能改變。⑤偶氮基質(zhì)顯色法檢測(cè)血清中LPS含量。⑥對(duì)各組動(dòng)物腸系膜淋巴結(jié)(Mesenteric lymphnodes，MLN)勻漿液

8、進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)以明確有無大腸桿菌感染。⑦采用免疫組織化學(xué)染色、western blot和real-time Q-PCR方法檢測(cè)各組小鼠肝臟組織中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-17A、TLR4、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TNF receptor-associated factor6，TRAF6)和核因子-κB(nuclear factorkappa B，NF-κB)蛋白及mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：①與正常對(duì)照組相比，D

9、SS+Vehicle組動(dòng)物體重明顯減輕，經(jīng)MSCs治療后，DSS+MSCs組動(dòng)物體重較DSS+Vehicle組明顯回升；與正常對(duì)照組相比，DSS+Vehicle組動(dòng)物DAI增加(4.00±0.65 vs0.00±0.00，P＜0.05)，結(jié)腸長度明顯縮短(3.93 cm±0.22 cm vs6.30 cm±0.55cm，P＜0.05)，結(jié)腸壁充血、水腫明顯(2.75±0.50 vs0.00±0.00，P＜0.05)，結(jié)腸組織病理切片顯示

10、淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞明顯浸潤，可見多灶性淺潰瘍，病理評(píng)分顯著增加(11.80±0.96 vs0.00±0.00，P＜0.05)；而經(jīng)過MSCs移植治療后，DSS+MSCs組DAI較DSS+Vehicle組明顯降低(0.30±0.46 vs3.05±0.25，P＜0.05)，同時(shí)結(jié)腸長度有所增長(5.18 cm±0.73 cm vs3.93 cm±0.22 cm，P<0.05)，結(jié)腸壁充血、水腫明顯減輕(1.11±0.45 vs2.75±

11、0.50，P＜0.05)，結(jié)腸組織病理切片結(jié)果顯示淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤明顯減少，病理評(píng)分顯著降低(5.0±0.62 vs11.8±0.96，P＜0.05)。②肝臟組織H&E和MT染色結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，DSS+Vehicle組可見肝內(nèi)匯管區(qū)膽管和膽管周圍淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞明顯浸潤，肝細(xì)胞排列散亂，細(xì)胞水腫、胞漿疏松化，同時(shí)肝小葉匯管區(qū)內(nèi)仍有少量纖維組織生成，有短的纖維間隔伸入肝小葉，未見纖維組織異常改變，病理評(píng)分顯著增加(

12、4.70±0.62 vs0.00±0.00，P＜0.05)，而經(jīng)過MSCs治療后，DSS+MSCs組淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤明顯減少，肝細(xì)胞變性損傷明顯減輕，病理評(píng)分降低顯著(2.56±0.40 vs4.70±0.62，P＜0.05)。③血清肝功能檢測(cè)顯示，同正常對(duì)照組相比，DSS+Vehicle組小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanineaminotransferase，ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotr

13、ansferase，AST)水平明顯升高(ALT：56.82 U/L±10.40 U/L vs34.50 U/L±8.23 U/L，P＜0.05；AST：104.25 U/L±17.26 U/L vs78.00 U/L±10.40 U/L，P＜0.05)，白蛋白(albumin，ALB)水平明顯降低(30.33 U/L±1.21 U/L vs38.60 U/L±1.18 U/L。P＜0.05)，血清總膽紅素(total bilirubi

14、n，TBIL)、直接膽紅素(direct bilirubin，DBIL)水平升高不明顯(TBIL：3.08μmol/L±0.57μmol/L vs2.49μmol/L±0.55μmol/L，P＞0.05；DBIL：1.47μmol/L±0.27μmol/L vs1.05μmol/L±0.36μmol/L，P>0.05)；而給予MSCs治療后，同DSS+Vehicle組相比，ALT、AST水平顯著降低(ALT：46.00 U/L±8.70

15、 U/L vs56.82 U/L±10.40 U/L，P＜0.05；AST：87.94 U/L±13.51 U/L vs104.25 U/L±17.26 U/L，P＜0.05)，ALB水平顯著升高(35.43 U/L±2.43 U/L vs30.33 U/L±1.21 U/L，P＜0.05)，TBIL、DBIL水平降低不明顯(TBIL：2.99μmol/L±0.70μmol/L vs3.08μmol/L±0.57μmol/L，P＞0.0

16、5；DBIL：1.24μmol/L±0.18μmol/L vs1.47μmol/L±0.27μmol/L，P＞0.05)。④與正常對(duì)照組相比，DSS+Vehicle組小鼠血清中LPS水平顯著增加(0.19 EU/mL±0.03 EU/mL vs0.11 EU/mL±0.01EU/mL，P＜0.05)；而DSS+MSCs組小鼠血清中LPS水平較DSS+Vehicle組明顯降低(0.15 EU/mL±0.01 EU/mL vs0.19 EU

17、/mL±0.03 EU/mL，P＜0.05)。⑤正常對(duì)照組小鼠MLN勻漿液中無細(xì)菌移位(0％)，與正常對(duì)照組相比，DSS+Vehicle組小鼠細(xì)菌移位率明顯增加(90％)，而DSS+MSCs組MLN細(xì)菌移位率較DSS+Vehicle組明顯降低(15％)。⑥免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)結(jié)果顯示：DSS+Vehicle組小鼠肝臟組織中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-17A、TLR4、TRAF6和NF-κB蛋白表達(dá)水平，較正常對(duì)照組顯著增加

18、(TNF-α：0.79±0.07 vs0.20±0.02，P＜0.05；IFN-γ：0.82±0.08 vs0.15±0.01，P＜0.05；IL-1β：0.75±0.08 vs0.10±0.01，P＜0.05；IL-17A：0.66±0.07 vs0.12±0.01，P＜0.05；TLR4:0.72±0.08 vs0.15±0.02，P＜0.05；TRAF6：0.61±0.06 vs0.10±0.01，P＜0.05；NF-κB：0.6

19、7±0.08 vs0.13±0.02，P＜0.05)，而DSS+MSCs組TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-17A、TLR4、TRAF6和NF-κB蛋白表達(dá)水平較DSS+Vehicle組明顯下降(TNF-α：0.27±0.03 vs0.79±0.08，P＜0.05；IFN-γ：0.41±0.05 vs0.82±0.08，P＜0.05；IL-1β：0.35±0.04 vs0.75±0.08，P＜0.05；IL-17A：0.35±0

20、.04 vs0.66±0.07，P＜0.05；TLR4：0.38±0.04 vs0.72±0.08，P＜0.05；TR AF6:0.29±0.03 vs0.61±0.06，P＜0.05；NF-κB：0.33±0.04 vs0.67±0.08，P＜0.05)。⑦Western blot和real-time Q-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組相比，DSS+Vehicle組小鼠肝臟組織中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-17A、TL

21、R4、TRAF6和NF-κB蛋白和mRNA表達(dá)水平明顯增加(蛋白：1.50±0.13 vs1.05±0.05，1.86±0.10 vs1.30±0.06，1.79±0.14 vs1.11±0.07，1.51±0.07 vs1.01±0.05，2.10±0.26 vs1.48±0.17，1.77±0.18 vs1.13±0.11，1.86±0.10 vs1.42±0.09，P＜0.05；mRNA：1.94±0.14vs1.00±0.00，

22、2.11±0.23 vs1.00±0.00，2.03±0.19 vs1.00±0.00，1.91±0.16 vs1.00±0.00，2.46±0.23 vs1.00±0.00，1.63+0.20 vs1.00±0.00，1.84±0.13 vs1.00±0.00，P＜0.05)；而DSS+MSCs組與DSS+Vehicle組小鼠比較肝臟組織中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-17A、TLR4、TRAF6和NF-κB蛋白和mRNA

23、表達(dá)水平明顯下降(蛋白：1.24±0.09 vs1.50±0.13，1.43±0.15 vs1.86±0.10,1.27±0.13 vs1.79±0.14，1.28±0.07 vs1.51±0.07，1.40±0.13 vs2.10±0.26，1.36±0.15 vs1.77±0.18，1.59±0.09 vs1.86±0.10，P＜0.05；mRNA：1.39±0.17 vs1.94±0.14，1.72±0.20 vs2.11±0.2

24、3，1.33±0.17 vs2.03±0.19，1.56±0.15 vs1.91±0.16，1.61±0.17 vs2.46±0.23，1.46±0.11 vs1.63±0.20，1.49±0.19 vs1.84±0.13，P＜0.05)。
　　結(jié)論：MSCs可減輕慢性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎結(jié)腸黏膜炎癥及相關(guān)肝膽病變；其機(jī)制可能與MSCs能降低腸黏膜通透性、促進(jìn)腸黏膜的修復(fù)、減少腸源性內(nèi)毒素血癥，從而下調(diào)LPS與TLR4介導(dǎo)的肝膽損傷有關(guān)。