早期浸潤心臟的中性粒細(xì)胞經(jīng)由HMGB1-TREM-1通路促進(jìn)柯薩奇病毒性心肌炎的作用和機(jī)制.pdf

1、病毒性心肌炎（VMC)是由多種病毒感染引起的以心臟組織彌漫性炎癥細(xì)胞浸潤和灶性心肌細(xì)胞壞死為特征的臨床常見且發(fā)病逐年升高的心血管疾病，其在全球發(fā)病率約0.12％-12%，在我國約為2%-15%，且被顯著低估。VMC的慢性化容易進(jìn)展為致死性的擴(kuò)張型心肌病(DCM)和心衰（HF)，是導(dǎo)致青少年猝死、心臟移植的主要原因，目前沒有對癥治療手段。闡明VMC的發(fā)病機(jī)制對于尋找臨床防治VMC的診療新策略具有重要意義。VMC的致病原包括腸道病毒、腺病毒

2、、流感病毒、細(xì)小病毒和巨細(xì)胞病毒等。其中腸道病毒屬的B3型柯薩奇病毒（CVB3)所引起的VMC在心臟移植中最為常見，研究最為廣泛。CVB3為單正鏈RNA病毒，通過糞口途徑在胃腸道少量復(fù)制后，經(jīng)血液循環(huán)感染心臟、胰腺、腦、肝臟、肺臟和脾臟等多器官，導(dǎo)致心肌炎、胰腺炎等多臟器疾病。CVB3感染雄性BALB/c小鼠可誘導(dǎo)與人類急性、慢性VMC類似的心肌炎癥疾病。目前認(rèn)為：CVB3的復(fù)制是導(dǎo)致最初期灶性心肌細(xì)胞壞死的主要原因，但隨后出現(xiàn)的急性和

3、慢性心肌炎，主要由病毒誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞心臟浸潤所介導(dǎo)，其中固有免疫與適應(yīng)性免疫均發(fā)揮重要作用。以往對于Thl、Thl7、Treg等適應(yīng)性免疫在VMC發(fā)病中的作用及機(jī)制研究較為充分，有關(guān)固有免疫在VMC發(fā)病中的作用日益受到重視。固有免疫是機(jī)體抗感染的第一道防線。位于機(jī)體黏膜及與外界交流的界面附近的固有免疫細(xì)胞，通過細(xì)胞表面或胞漿的多種模式識別受體（PRRs)如 Toll樣受體（TLRs)等，識別病原體所共有的病原相關(guān)分子模式（PAMPs)，

4、激活特定的固有免疫信號通路，通過合成I型干擾素、多種炎癥細(xì)胞因子和上調(diào)抗原提呈細(xì)胞的APC功能來參與對病原體感染的快速控制。在病毒性心肌炎早期，心臟浸潤的固有免疫細(xì)胞包括N K、Y5T、巨噬細(xì)胞等，發(fā)揮分泌IFNy、IL-17等炎癥因子、直接抗病原體或者間接調(diào)控適應(yīng)性T細(xì)胞應(yīng)答的多種重要功能。本研究分為三個部分：
　　第一部分：CVB3感染最早期心臟浸潤的中性粒細(xì)胞在急性病毒性心肌炎中的重要促炎功能：⑴BALB/c小鼠病毒性心肌炎

5、的建立。CVB3感染雄性易感BALB/c小鼠建立的急性V M C動物模型與臨床VMC病患特征非常相似。以1000TCID5o效價的CVB3 lOOul腹腔感染BALB/c雄鼠，發(fā)現(xiàn)感染第3天，病毒復(fù)制達(dá)峰值，小鼠開始死亡，至第7天，小鼠體重減輕率達(dá)20%，存活率50%-80%，心臟H E病理顯示小鼠心臟有大量炎性細(xì)胞浸潤、局灶性心肌細(xì)胞壞死。提示CVB3小鼠病毒性心肌炎模型成功建立⑵CVB3感染急性期骨髓和外周血中性粒細(xì)胞均大量擴(kuò)增。作

6、為在急性細(xì)菌感染中發(fā)揮重要作用的中性粒細(xì)胞，其在病毒感染中的作用鮮有報道。為檢測CVB3急性感染小鼠后的中性粒細(xì)胞的動力學(xué)改變，我們首先檢測了 CVB3感染0/3/7天骨髓和外周血中CDllb+Ly6G+中性粒細(xì)胞的比例和絕對數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：CVB3感染后，如同細(xì)菌急性感染誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞的快速動員，骨髓和外周血中的中性粒細(xì)胞比例均顯著上調(diào)，而絕對數(shù)在感染第7天均顯著增高了10倍以上，提示中性粒細(xì)胞在病毒感染后發(fā)生快速的動員與增殖。⑶CV

7、B3感染急性期心臟與脾臟均存在大量中性粒細(xì)胞浸潤。流式檢測CVB3感染后小鼠心臟和脾臟中中性粒細(xì)胞的變化，發(fā)現(xiàn)：心臟中，感染1.5-3天，中性粒和單核細(xì)胞浸潤顯著增髙，在1.5天達(dá)峰值，隨后降低；而巨噬細(xì)胞、N K及仲T細(xì)胞則在0-3天過程中持續(xù)增高。感染36h，心臟浸潤單核細(xì)胞數(shù)目約為中性粒細(xì)胞的2倍，兩種細(xì)胞是心臟浸潤最多數(shù)量的細(xì)胞。而在脾臟，感染0-3天，脾臟浸潤各免疫細(xì)胞除單核外比例均顯著增多，中性粒細(xì)胞比例持續(xù)增加（C D l

8、lb+細(xì)胞的14%-46%，1.5X105/||J?/day3),其絕對數(shù)明顯高于單核、巨噬細(xì)胞等。⑷中和抗體清除試驗(yàn)評估中性粒細(xì)胞在CVB3病毒性心肌炎中的作用。為了檢測中性粒細(xì)胞在急性V M C發(fā)病中的作用，采用anti-Ly6G中和抗體特異性清除小鼠體內(nèi)中性粒細(xì)胞，檢測急性VMC的發(fā)病和病毒復(fù)制情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：兩次靜脈注射中和抗體外周血中性粒細(xì)胞的清除效率高達(dá)95%；清除中性粒細(xì)胞可增加小鼠死亡率；清除中性粒細(xì)胞可顯著減輕心臟炎性

9、細(xì)胞浸潤和局灶性壞死；脾臟浸潤的C D llb+髓系細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、CD3+T、CD4+T和 CD8+T細(xì)胞數(shù)目均顯著降低；清除中性粒細(xì)胞對病毒復(fù)制影響不顯著。提示：在VMC發(fā)病過程中，中性粒細(xì)胞的早期浸潤通過放大炎癥效應(yīng)發(fā)揮促進(jìn)病毒性心肌炎作用。
　　第二部分：中性粒細(xì)胞通過感知心肌細(xì)胞釋放的危險信號HMGB1發(fā)揮促進(jìn)心肌炎作用：⑴CVB3感染小鼠心肌釋放高水平HMGB1的動力學(xué)。在BALB/c小鼠急性VM C模

10、型中，首先證實(shí)CVB3的載量和復(fù)制水平在第3-4天間達(dá)到高峰，第7天已降至極低水平。提示心肌細(xì)胞壞死高峰也在第3-4天。隨后以Westem-blot檢測感染0-3-7天心臟的H M G B1蛋白水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：CVB3感染后心臟HMGB1水平顯著升高（p<0.05)，并在第3天達(dá)到頂峰，隨后下降至第7天達(dá)本底，顯示與CVB3心肌細(xì)胞復(fù)制相一致的動力學(xué)。⑵CVB3體外感染原代心肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞顯著上調(diào)HMGB1的表達(dá)。體外以CVB3感染乳

11、鼠原代心肌細(xì)胞和Raw264.7巨噬細(xì)胞系，檢測CVB3體外作用于心肌細(xì)胞的HMGB1的上調(diào)情況。結(jié)果表明：有本底表達(dá)的乳鼠原代心肌細(xì)胞在感染0-24小時H M G B1水平持續(xù)增高;C V B3作用Raw264.7細(xì)胞后6-24小時HMGB1表達(dá)水平顯著升高。提示CVB3體內(nèi)體外作用于心肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，都顯著促進(jìn)危險信號分子HMGB1的表達(dá)和釋放。⑶以甘草皂苷阻斷HMGB1體內(nèi)作用研究對小鼠急性VMC發(fā)病的影響。為了闡明心臟釋放的H

12、MGB1的作用，CVB3感染lh后，以HMGB1的藥理學(xué)阻斷劑甘草皂苷GZA每隔2天經(jīng)腹腔注射連續(xù)3次，以阻斷游離HMGB1功能。結(jié)果提示：以GZA阻斷HMGB1的體內(nèi)功能后，小鼠生存率顯著升高，體重減輕率明顯下降，心臟組織的C V B3病毒載量與復(fù)制均顯著下降（p<0.05)，與發(fā)生典型的急性VM C的PBS處理組小鼠相比，GZA處理小鼠心臟炎癥浸潤顯著減少；流式檢測外周血及脾臟髓系細(xì)胞比例發(fā)現(xiàn)：G Z A處理小鼠脾臟C D l l

13、b+Ly6Chigh單核細(xì)胞和CDllb+Ly6G+中性粒細(xì)胞比例均顯著降低；外周血單核細(xì)胞比例與數(shù)目均顯著減少，但中性粒細(xì)胞無顯著變化。提示阻斷小鼠體內(nèi)游離HMGB1的功能，可通過減少病毒復(fù)制、減少外周血單核細(xì)胞數(shù)目及其向心臟組織的浸潤、中性粒細(xì)胞向心臟組織的浸潤而顯著減輕CVB3感染誘導(dǎo)的病毒性心肌炎。⑷提取中性粒細(xì)胞體外經(jīng)HMGB1預(yù)刺激后回輸小鼠對CVB3誘導(dǎo)心肌炎的影響。為證實(shí)CVB3裂解心肌細(xì)胞釋放的大量HMGB1損傷信號是

14、否可以被中性粒細(xì)胞所感知、應(yīng)答并發(fā)揮炎癥調(diào)控作用，我們優(yōu)化了小鼠骨髓中性粒細(xì)胞的提純(純度達(dá)90%以上)，以5*105數(shù)目的W T小鼠中性粒、C V B3感染小鼠中性粒、HMGB1蛋白預(yù)剌激4小時的WT小鼠中性粒細(xì)胞，經(jīng)尾靜脈輸注感染CVB31天的小鼠，再檢測心肌炎發(fā)病。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：心肌炎：與單純CVB3感染小鼠相比，W T中性粒細(xì)胞輸注組小鼠生存率無顯著改變，心肌炎癥有少量增加；與WT中性粒相比，CVB3感染小鼠中性粒細(xì)胞回輸組生存率顯

15、著下降（p<0.05)、體重顯著減輕（p<0.05)，心肌炎顯著加重(p<0.05)；提示C V B3感染小鼠中性粒細(xì)胞具有加重心肌炎的作用。而 HMGB1預(yù)刺激的WT中性粒細(xì)胞回輸小鼠，只有心臟炎癥浸潤與WT中性?；剌斚啾蕊@著增加（p<0.05)，與C V B3感染小鼠中性粒回輸組結(jié)果相似；心臟病毒復(fù)制：與單純CVB3感染相比，W T中性粒細(xì)胞回輸組無顯著差異；CVB3感染小鼠中性粒細(xì)胞回輸組心臟復(fù)制顯著升髙（25倍，p<0.01)；

16、而HMGB1預(yù)刺激中性粒細(xì)胞回輸組病毒復(fù)制雖不及感染小鼠中性粒細(xì)胞的強(qiáng)烈促病毒復(fù)制作用，但與其他組相比仍顯著促進(jìn)病毒復(fù)制（p<0.05)。提示： HMGB1蛋白可活化中性粒細(xì)胞的促炎和促進(jìn)病毒復(fù)制功能，可產(chǎn)生與CVB3感染中性粒細(xì)胞相接近的功能；脾臟淋巴細(xì)胞亞群：與正常小鼠相比，CVB3感染小鼠脾臟淋巴細(xì)胞比例與絕對數(shù)均顯著增加；與單純CVB3感染小鼠相比，W T中性粒細(xì)胞回輸組無顯著差異；而與之相比，CVB3感染小鼠中性粒細(xì)胞回輸組幾

17、乎所有髓系細(xì)胞和淋巴細(xì)胞均顯著地減少（p<0.01)，特別是中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和YST細(xì)胞。提示感染小鼠的中性粒細(xì)胞具有促進(jìn)脾臟病毒復(fù)制、導(dǎo)致各免疫細(xì)胞減少。而HMGB1蛋白預(yù)刺激W T中性粒細(xì)胞回輸組，則與CVB3感染小鼠中性粒細(xì)胞回輸組的效果幾乎一致，即通過促進(jìn)病毒復(fù)制顯著摧毀免疫細(xì)胞；外周血免疫細(xì)胞亞群：改變與脾臟的趨勢一致。
　　第三部分：中性粒細(xì)胞通過TREM1-HMGB1通路促進(jìn)CVB3誘導(dǎo)

18、的急性病毒性心肌炎：⑴中性粒細(xì)胞經(jīng)C V B3感染后的TREM-1受體表達(dá)水平最為顯著上調(diào)。實(shí)時定量PCR分析BALB/c小鼠骨髓來源中性粒細(xì)胞表面HMGB1受體TLR4和RAGE的本底表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：中性粒細(xì)胞幾乎不表達(dá)RAGE，TLR4本底表達(dá)顯著高于RAGE，而以CVB3感染3天小鼠心臟勻漿液體外刺激中性粒細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)TLR4顯著上調(diào)。而后檢測了 HMGB1的另一可能受體-----TREM-1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)生理狀況下，TREM1本底表

19、達(dá)顯著高于T L R4;而在感染3天心臟勻漿液刺激后 T R E M1表達(dá)進(jìn)一步顯著增高（p<0.05，近3倍)，成為中性粒細(xì)胞上水平最高的 H M G B1受體。提示壞死心肌細(xì)胞釋放的HMGB1，可被中性粒細(xì)胞高表達(dá)的TREM-1受體識別。⑵V M C小鼠心臟中TREM-1表達(dá)水平的動力學(xué)。為檢測小鼠急性V M C期心臟組織TREM-1的表達(dá)水平，實(shí)時定量P C R檢測CVB3感染心臟組織RNA。發(fā)現(xiàn)：本底很低的TREM-1水平顯著升

20、髙，在第6天達(dá)高峰（10倍，p<0.05)。通過流式檢測分析心臟浸潤的中性粒細(xì)胞、單核及巨噬細(xì)胞表面的TREM-1水平，發(fā)現(xiàn)：感染后第3天，心臟浸潤的單核、巨噬和中性粒細(xì)胞均顯著增多；且表面的TREM-1水平均顯著升髙，中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞表面的TREM1水平髙于巨噬細(xì)胞。⑶siRNA下調(diào)TREM-1對細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子的影響。構(gòu)建了TREM-1 siRNA,可顯著下調(diào)細(xì)胞中70%以上TREM-1的表達(dá)。為檢測TREM1介導(dǎo)的固有免疫細(xì)胞

21、炎癥因子分泌的影響，首先TREM-1 siRNA轉(zhuǎn)染Raw264.7細(xì)胞36小時，隨后以CVB3(M01=10)作用，RT-PCR檢測炎癥細(xì)胞因子的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：TREM-1表達(dá)顯著降低，導(dǎo)致IL-lp和IL-6的分泌顯著降低，但 TNFa變化不大。提示巨噬細(xì)胞表面的TREM-1在 C V B3感染中有促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子分泌作用。⑷HMGB1-TREM1通路介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞釋放抗菌肽、NET、炎癥功能。為探討HMGB1對于中性粒細(xì)胞的直

22、接效應(yīng)，取正常小鼠骨髓中性粒細(xì)胞，體外加入CVB3病毒、HMGB1或CVB3感染3天小鼠心臟勻漿液，以熒光抗體染色（DAPI、anti-Ly6G)檢測觀察是否出現(xiàn)細(xì)胞外誘捕網(wǎng)（NET)結(jié)構(gòu)，結(jié)果尚不理想。同時檢測細(xì)胞上清中抗菌肽CRAMP、S100A8/A9的表達(dá)，結(jié)果尚在進(jìn)行中。以重組HMGB1或CVB3感染3天小鼠心臟勻漿液刺激小鼠骨髓中性粒細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)：HMGB1或 CVB3感染3天小鼠心臟勻漿液可顯著促進(jìn)中性粒細(xì)胞分泌IL-17A

23、、T N F a、IFNy和中性粒細(xì)胞趨化因子C X C L1等；提示中性粒細(xì)胞體外經(jīng)損傷信號DAMP刺激，可顯著增髙炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)（結(jié)果重復(fù)中）。⑸體內(nèi)特異性阻斷TREM-1與配體結(jié)合對C V B3誘導(dǎo)V M C的影響。為直接證實(shí)TREM1在CVB3誘導(dǎo)的V M C發(fā)病中的作用，在CVB3感染的第-1、3天以TREM-1特異阻斷劑（lOOpg/鼠）LP17注射小鼠，評估V M C的發(fā)病情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：相對CVB3感染小鼠，LP17

24、處理小鼠的死亡率和體重減輕率都顯著改善（p<0.05)。心臟炎性細(xì)胞浸潤顯著減少（p<0.05);第7天心臟勻漿液各炎癥細(xì)胞因子水平均顯著降低（p<0.01)。提示TREM1在 CVB3誘導(dǎo)的V M C中具有放大炎癥的作用。⑹小鼠中性粒細(xì)胞經(jīng)TREM1-HMGB1通路促進(jìn)C V B3誘導(dǎo)的心肌炎。為闡明中性粒細(xì)胞表面的TREM1識別HMGB1后在CVB3心肌炎的功能，以HMGB1蛋白預(yù)刺激中性粒細(xì)胞回輸、或同時予以腹腔注射LP17特異抑

25、制TREM1功能，檢測CVB3感染7天病毒復(fù)制、心臟炎癥浸潤的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：小鼠生存率未見顯著改變，但是以LP17體內(nèi)阻斷TREM1功能后，HMGB1蛋白預(yù)刺激中性粒細(xì)胞回輸導(dǎo)致的小鼠體重劇烈減輕得以顯著回升。即阻斷TREM1可顯著抑制中性粒細(xì)胞的促病毒復(fù)制功能；心肌炎：LP17肽處理后顯著減輕了 HMGB1預(yù)刺激的中性粒細(xì)胞回輸小鼠導(dǎo)致的心肌炎顯著加劇。提示LP17阻斷TREM1產(chǎn)生了一定治療效果；病毒復(fù)制：LP17肽處理小鼠顯著降

26、低了 HMGB1預(yù)刺激中性粒細(xì)胞回輸小鼠導(dǎo)致的心臟病毒復(fù)制顯著加劇，且?guī)缀趸貜?fù)至WT中性粒回輸小鼠的水平。提示LP17對于TREM1的阻斷產(chǎn)生了抑制病毒復(fù)制的治療效果；脾臟淋巴細(xì)胞亞群：L P17肽阻斷TREM-1，發(fā)現(xiàn)脾臟淋巴細(xì)胞浸潤急劇下降的情況均顯著得以改善，所有細(xì)胞均顯著回升（P<0.05)，特別是中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、CD4+T和CD8+T細(xì)胞數(shù)目均幾乎回復(fù)到單純C V B3感染的水平；但巨噬細(xì)胞僅發(fā)生部分回復(fù)，仍顯著減少（p