Calpain在柯薩奇B3病毒誘導的病毒性心肌炎中的作用及其機制研究.pdf

1、前言：
　　病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是心肌局限性或彌漫性的炎性病變，可呈急性或慢性病程。絕大多數(shù)患者預后良好;約10-15％的患者由于急性期后炎癥持續(xù)、病情遷延反復，進展為擴張型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)。在原發(fā)性擴張型心肌病中，高達60％的患者能檢測到病毒感染。表明病毒直接感染是心肌炎心肌病重要的觸發(fā)因素之一。
　　多種病毒可誘導病毒性心肌炎發(fā)病，其中以

2、腸道病毒中柯薩奇B組病毒3型(Coxsackievirus B，CVB3)最為常見，在急性心肌炎及恢復期病人體內(nèi)均可檢測到CVB抗體滴度升高，因此尋找CVB3導致病毒性心肌炎的治療靶點，探尋可能的干預途徑，對病毒性心臟病的治療具有重要的臨床意義。
　　柯薩奇B組病毒引起心肌組織損傷、進展為擴張型心肌病并最終引起心力衰竭病理過程的具體機制尚不十分清楚。通常將整個過程分為三個階段:第一階段，病毒對心肌細胞的直接損傷;第二階段，繼發(fā)性細

3、胞或體液免疫反應對心肌細胞的損傷;第三階段，損傷心肌的重塑及擴張型心肌病階段。
　　病毒感染觸發(fā)心肌組織損傷，引起持續(xù)低水平的炎癥反應，導致持續(xù)性心肌損傷及修復性纖維化的發(fā)生，炎癥細胞產(chǎn)生基質(zhì)降解酶類，共同導致左心室擴張和心功能損傷，形成了病毒性心臟病“病毒性心肌炎-擴張型心肌病-慢性心力衰竭”的連續(xù)病理過程。因此，病毒持續(xù)復制、心肌炎癥細胞浸潤以及心肌組織纖維化是柯薩奇B3病毒誘導的病毒性心臟病發(fā)病及進展的三個重要機制。

4、　　Calpain是一類主要存在于細胞質(zhì)中的Ca2+依賴性的半胱氨酸蛋白酶，目前已知有15個家族成員，分為組織特異性和非特異性兩大類。Calpain底物眾多，生理功能復雜多樣，至今尚未完全明了。通常calpain不是將蛋白質(zhì)底物降解成小多肽或氨基酸，而是通過特定地限制性蛋白水解，調(diào)節(jié)受體蛋白、細胞骨架蛋白、肌原纖維、蛋白激酶等底物的活性、結(jié)構(gòu)和功能，從而參與信號轉(zhuǎn)導、細胞的運動與遷移、組織修復、細胞凋亡等體內(nèi)生理過程;在多種病理狀態(tài)下包

5、括肌肉萎縮、某些癌癥、缺血-再灌注損傷、高血壓、糖尿病等，calpain的活性均增高，并在病理發(fā)病過程中起重要作用。
　　目前，許多研究顯示calpain作為一種功能多樣、分布廣泛的酶類，與某些種屬病毒的復制過程、機體免疫炎癥反應過程及組織纖維化發(fā)生三個方面均有相關(guān)性。但是，在柯薩奇B3病毒導致的病毒性心肌炎發(fā)病及進展過程中是否存在作用，又起著怎樣的作用，目前尚未見報道。鑒于此，在本研究中，我們擬在目前已知的柯薩奇B3病毒導致病毒

6、性心臟病的發(fā)病機制基礎(chǔ)上，進一步探討calpain在其中的具體作用及機制，以期闡明calpain作為病毒性心肌炎治療靶點的可能性。
　　第一部分:C57BL/6品系小鼠急、慢性病毒性心肌炎模型及擴張型心肌病模型的建立
　　[目的]探討以柯薩奇B3病毒(coxsackievirus B3，CVB3)感染C57BL/6小鼠建立急慢性病毒性心肌炎及擴張型心肌病模型的方法。
　　[方法]以初始體重/周齡為依據(jù)將小鼠分為兩組:A

7、組(3-4周齡，11-15g)及B組（5-6周齡，15-20g）;每組分別下設(shè)三個病毒感染滴度亞組，即:1，000TCID50/ml亞組、10，000TCID50/ml亞組、100，000TCID50/ml亞組以及對照組。感染7天后觀察心肌組織中是否存在感染病毒以及心肌炎癥細胞浸潤的情況，以探索建立急性病毒性心肌炎的方法。在此基礎(chǔ)上，依照建立急性病毒性心肌炎模型的方法，以病毒直接感染的方法，感染2月及3月分別建立慢性病毒性心肌炎及擴張型

8、心肌病模型。
　　[結(jié)果]在急性病毒性心肌炎模型建立過程中，免疫組化染色發(fā)現(xiàn)病毒感染各組心肌組織中存在病毒包膜蛋白VP1;低體重組各病毒滴度感染亞組表現(xiàn)出較高的死亡率(40-100％)，高體重組小鼠感染后各亞組體重呈下降趨勢;組織病理學觀察發(fā)現(xiàn)低體重組小鼠存活個體心肌存在炎癥浸潤情況，而死亡個體未發(fā)現(xiàn)明顯炎癥細胞浸潤;高體重組小鼠心肌隨感染病毒滴度的增高心肌炎癥情況呈增高趨勢，且存活率高。以建立急性病毒性心肌炎模型條件感染小鼠后2

9、月與3月，與Balb/c品系小鼠相比，C57BL/6品系小鼠心臟功能無明顯變化，心肌組織病理學未見明顯炎癥浸潤、組織纖維化改變。
　　[結(jié)論]利用5-6周齡/15-20g體重的 C57BL/6品系小鼠，以100，000TCID50/ml CVB3、0.3ml劑量感染，可以建立急性病毒性心肌炎模型;但是通過病毒直接感染的方法，無法在C57BL/6品系小鼠建立慢性病毒性心肌炎及擴張型心肌病模型。
　　第二部分:Calpastat

10、in過表達對柯薩奇B3病毒感染誘導的病毒性心肌炎心臟保護作用的研究
　　[目的]Calpain是一類存在于細胞質(zhì)中的鈣離子依賴性的半胱氨酸蛋白酶，在體內(nèi)底物眾多，病理生理功能多樣，其活性受到內(nèi)源性特異性抑制劑calpastatin的負向調(diào)控。研究證明calpain參與病毒性心肌炎發(fā)病，并影響某些腸道病毒復制過程;但是關(guān)于calpain在柯薩奇B3病毒(Coxsackievirus B3，CVB3)導致的病毒性心肌炎中的作用目前尚未

11、見報道。本研究擬利用過表達calpain內(nèi)源性抑制劑calpastatin的轉(zhuǎn)基因小鼠（Tg-CAST小鼠），觀察calpain在CVB3誘導的病毒性心肌炎中的作用，并探討其可能機制。
　　[方法]以CVB3直接感染Tg-CAST小鼠建立病毒性心肌炎模型，同時設(shè)立相應對照組。觀察心重/體重比值變化情況，行HE染色觀察心肌組織炎癥細胞浸潤情況并進行病理學評分，同時檢測外周血心肌損傷標志物CK-MB、cTnⅠ的水平。分子生物學方法分別

12、檢測心肌組織中病毒包膜蛋白VP1表達水平變化;纖維化相關(guān)因子Smad3、MMP2表達及活性變化;炎癥相關(guān)因子IL17、IFNγ、穿孔素(perforin，PFN)表達變化。
　　[結(jié)果]Tg-CAST小鼠心肌組織中calpastatin表達上調(diào)，calpain活性受到明顯抑制。與病毒感染野生型對照相比，CVB3感染的Tg-CAST小鼠心重/體重比值降低，心肌組織炎癥浸潤減輕，對應心肌病理評分下降，同時外周血心肌損傷標志物CK-MB

13、、cTnⅠ的水平降低;心肌組織內(nèi)VP1表達下降;心肌纖維化相關(guān)因子Smad3表達明顯下降，MMP2表達和活性明顯下降;炎癥相關(guān)因子IL17、IFNγ及PFN在心肌組織內(nèi)的分布及表達也明顯下降。
　　[結(jié)論]以上研究說明calpastatin過表達對柯薩奇B3病毒導致的病毒性心肌炎表現(xiàn)出顯著的心臟保護作用，提示calpain在病毒性心肌炎發(fā)病中的重要作用。病毒性心肌炎發(fā)病及進展過程中，病毒的持續(xù)復制、機體免疫炎癥反應以及心肌纖維化是

14、重要的致病機制;而圍繞這三個方面展開的研究結(jié)果顯示calpain參與CVB3復制，參與調(diào)控炎癥因子生成，參與心肌纖維化相關(guān)因子表達;因此，calpain可能通過以上多種機制參與病毒性心肌炎發(fā)病。
　　第三部分: Calpain介導自噬與凋亡在柯薩奇B3病毒復制中的作用研究
　　[目的]Calpain是存在于細胞內(nèi)的鈣離子依賴性的中性半胱氨酸蛋白酶，參與許多生理及病理過程。有報道稱calpain參與病毒復制、自噬及凋亡發(fā)生過程

15、。然而，calpain通過自噬-凋亡串話(cross-talk)參與柯薩奇病毒復制的具體過程尚不清楚。本部分內(nèi)容擬就此問題進行討論。
　　[方法]以CVB3直接感染培養(yǎng)的大鼠原代心肌細胞及H9c2心肌細胞系，建立體外病毒性心肌炎模型，分別觀察感染后細胞內(nèi)calpain活性、caspase3活性、細胞自噬動態(tài)變化情況;在適宜的時間窗內(nèi)，通過藥物調(diào)節(jié)calpain活性，觀察其對細胞凋亡及自噬情況的影響;通過調(diào)節(jié)自噬活性變化，觀察細胞凋

16、亡情況的影響;在培養(yǎng)大鼠原代心肌細胞中，觀察調(diào)節(jié)calpain活性及自噬活性，對病毒包膜蛋白VP1表達及病毒子代復制能力的影響。
　　[結(jié)果]病毒感染后24小時內(nèi)，calpain活性被持續(xù)激活。抑制calpain活性減少了自噬的發(fā)生而增加calpain活性則促進了自噬的發(fā)生，說明calpain介導了CVB3感染過程中自噬的發(fā)生過程;在感染后10小時內(nèi)，calpain活性也抑制了凋亡的發(fā)生;而在此時間段內(nèi)，增強與抑制自噬分別抑制和促

17、進了凋亡的發(fā)生，說明CVB3感染誘導的自噬抑制了細胞的凋亡;抑制calpain活性及自噬活性分別減少了病毒復制水平。
　　[結(jié)論]在CVB3感染過程中，病毒感染激活calpain，繼而通過增加自噬活性，進一步抑制宿主細胞細胞凋亡，并促進子代病毒復制。
　　第四部分:Calpain對柯薩奇B3病毒性心肌炎心肌纖維化發(fā)生的影響及機制研究
　　[目的]觀察抑制calpain活性后急性柯薩奇B3病毒性心肌炎小鼠心肌組織總體纖維

18、化程度的改變以及體外情況下calpain對心肌成纖維細胞增殖和遷移能力的影響，初步揭示calpain在病毒性心肌炎心肌纖維化過程中的作用。
　　[方法]以CVB3單次感染C57BL/6品系小鼠及Tg-CAST轉(zhuǎn)基因小鼠建立病毒性心肌炎模型;同期小鼠腹腔無菌注射等劑量不含病毒的DMEM液作為對照組。小鼠于第7天斷頸處死，取出心臟，常規(guī)方法行組織病理學行Mallory染色觀察心肌纖維化程度，并測量總體纖維化面積百分比;行天狼猩紅染色觀

19、察心肌膠原分布情況。無菌條件下取SD大鼠乳鼠心肌成纖維細胞，經(jīng)純化后鋪板貼壁，去血清培養(yǎng)24h同步化，加入含梯度稀釋的ALLN，20％ FBS的細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)24h;同時設(shè)無ALLN干預的心肌成纖維細胞同條件培養(yǎng)作為對照組;每組設(shè)5個復孔;采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法檢測不同濃度的藥物對成纖維細胞增殖的影響。分組及干預同上，將成纖維細胞接種到6孔板，采用細胞劃痕損傷實驗檢測不同濃度藥物對成纖維細胞遷移的影響

20、。
　　[結(jié)果]急性病毒性心肌炎小鼠心肌纖維化的總體程度比正常對照組及藥物干預組均明顯增加(P＜0.01);抑制Calpain的活性后，其心肌纖維化總體程度則有顯著的下降(P＜0.01)。體外培養(yǎng)成纖維細胞實驗中，與正常對照組相比低濃度的ALLN(0.625μg/ml)作用于成纖維細胞24h后，即可導致成纖維細胞的吸光度值下降，即成纖維細胞增殖率下降，差別具有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.001);ALLN濃度繼續(xù)增加后，成纖維細胞的吸