抑制JAK-STAT信號通路對重癥急性胰腺炎大鼠肝損傷的保護作用.pdf

1、重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是一種嚴重危及生命的全身性疾病，起病急，病情重，并發(fā)癥多，病死率達20％-30％，該病早期即可累及肺、腎、肝等胰外臟器，導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征（multi-organ dysfunction syndrome，MODS），競而發(fā)展為多臟器的功能衰竭（multi-organ failure，MOF）。盡管肝臟有較強的代償和再生能力，肝功能異常仍會時常出現(xiàn)，而且是

2、SAP進展過程中的一個致命的并發(fā)癥，提示該病預(yù)后不良。由于胰腺血液在回流心臟前需經(jīng)過肝的代謝和處理，而肝巨噬細胞占整個單核巨噬細胞系統(tǒng)的80％～90％，是體內(nèi)最大的固定巨噬細胞群，因此，肝是SAP常累及的胰外器官之一。而且，肝功能損害已被認為是判斷SAP嚴重程度的重要指標，已作為獨立的指標合并進了預(yù)測AP嚴重程度的Ranson評分和急性生理慢性健康評估Ⅱ（Acute Physiological Chronic Health Evalua

3、tion Ⅱ，APACHE Ⅱ）系統(tǒng)，對預(yù)測SAP臨床預(yù)后尤為重要。關(guān)SAP出現(xiàn)臟器并發(fā)癥的機制，目前還不甚清楚。1988年，Rindermecht提出了急性胰腺炎發(fā)病機制的新見解，認為胰腺在胰酶異常激活所造成的損害過程中，激活了單核巨噬細胞，進而造成促炎細胞因子和活性氧簇的釋放，它們又可進一步導(dǎo)致粒細胞和內(nèi)皮細胞的過度激活而釋放大量的炎癥介質(zhì)，形成所謂的“第二次打擊”，導(dǎo)致炎癥從胰腺局部迅速擴散到全身，發(fā)生全身炎癥反應(yīng)綜合征（syst

4、emic inflammatory response syndrome，SIRS），MODS以致死亡。 早在1984年就有報道，80％AP患者有肝功能損害，血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）水平升高，并且LDH水平與AP的嚴重程度呈正相

5、關(guān)。實驗研究表明，AP時可見明顯的肝細胞病理改變。光鏡下，可見肝細胞變性、散在的液化性壞死灶，Kupffer細胞腫脹。電鏡下，可見糖原顆粒減少；脂質(zhì)小滴大小和數(shù)目增加；線粒體腫脹，其基質(zhì)和嵴變性；自噬體和溶酶體增多；肝竇內(nèi)皮損害伴吞噬細胞活性增加。并出現(xiàn)肝細胞內(nèi)酸中毒、鈉離子超載及肝細胞生物能的耗竭等生化改變以及肝細胞凋亡顯著增多。目前，細胞因子在SAP的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用已越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的重視，干預(yù)或拮抗細胞因子的治

6、療將成為SAP具有發(fā)展前景的治療方法。 Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（janus kinase/signal transducer and activator of-transcription，JAK/STAT）信號通路是細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑，它廣泛參與細胞增殖分化、凋亡、炎癥、腫瘤等多種生理、病理生理過程，對機體有重要影響。它把細胞膜上感受的信號直接傳遞到核內(nèi)，啟動基因轉(zhuǎn)錄，環(huán)節(jié)少而簡潔。JAK/STAT信號通

7、路由JAKs蛋白家族（JAK1、JAK2、JAK3、TYK2）和STATs蛋白家族（STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6）組成。JAK是STAT的上游共有激酶。細胞外可溶性信號分子（細胞因子、生長因子等）識別并與細胞膜上的特異受體結(jié)合后誘導(dǎo)受體聚化構(gòu)成二聚體或三聚體，在胞漿內(nèi)形成高親和性的JAKs結(jié)合位點，JAKs與受體胞漿區(qū)域的JAKs結(jié)合位點結(jié)合后發(fā)生自身或與受體交叉酪氨酸磷酸化而活

8、化，活化的JAKs進一步募集細胞漿內(nèi)相應(yīng)的信號傳導(dǎo)和STATs，導(dǎo)致STATs二聚化、活化、核移位，結(jié)合到相應(yīng)基因的啟動子上，啟動基因表達，發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)。AG490（tyrphosin AG490）是一種人工合成的苯亞甲基丙二腈的脂類衍生物，結(jié)構(gòu)類似于酪氨酸，可以和受體酪氨酸激酶競爭結(jié)合位置，特異性阻滯各種細胞因子引起的JA K2和下游分子STA T 3的的磷酸化激活，從而阻斷下游激酶STAT的活化進而抑制細胞因子的生理和病理效應(yīng)

9、。 基于此，本研究將通過體內(nèi)實驗建立SAP模型，利用Western blot、免疫組化等技術(shù)研究實驗性SAP肝組織中JAK2的表達情況，并通過JAK/STAT信號通路抑制劑AG490進行干預(yù)研究，通過觀察SAP大鼠肝組織JAK2蛋白的表達情況及其與肝功能和病理形態(tài)損傷之間的關(guān)系，探討重癥急性胰腺炎時JAK/STAT通路活化在肝損傷中的作用。以從分子水平闡明SAP肝損傷的發(fā)病機制，為SAP肝損傷臨床治療提供一個新的思路?！　?

10、 目的:　　 1、建立SAP大鼠模型。觀察SAP時出現(xiàn)的肝功能和胰腺、肝臟損傷組織學(xué)方面的改變，同時觀察JAK2蛋白在正常對照組和SAP造模組肝組織中的表達情況；了解JAK/STAT信號通路在重癥急性胰腺炎肝損傷中的作用?！　?2、觀察JAK/STAT信號通路抑制劑AG490對SAP時肝損傷的治療作用，以及對肝臟JAK2蛋白表達的影響。對SAP疾病進程中胰外器官損傷發(fā)生率高、病死率高的原因進行初步探討，為臨床最終達到提

11、高SAP療效、減少SAP的并發(fā)癥及降低其病死率提供理論及實驗依據(jù)?！　?材料和方法:　　 1、SD大鼠56只，隨機分3組：正常對照組（NC組，n=8）；SAP造模組（SAP組，n=24）；SAP造模+AG490組（SAP-AG組，n=24）。每組再分為6、12、18h三個時間點，每個時間點各8只大鼠。　　 2、采用4％牛磺膽酸鈉逆行注入胰膽管誘發(fā)SAP模型。SAP組于造模后2h腹腔注射生理鹽水1ml，12h后重復(fù)

12、1次；SAP-AG組于造模前半小時腹腔注射AG490。NC組模擬胰膽管穿刺操作，但不注射藥物?！　?3、NC組、SAP-S組與SAP-AG490組于6、12、18h心臟穿刺抽血，測血清淀粉酶（AMY）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平，并測定腹水量，留取標本在光鏡下觀察胰腺及肝組織病理學(xué)改變，采用免疫組化方法檢測JAK2蛋白在肝臟中的表達定位，并用Western blotting方法檢測肝組織JAK2蛋白的表達?！?/p>

13、　 4、本研究所有計量資料以均數(shù)土標準差（x±s）表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用SPSS13.0軟件，計量資料采用單因素方差分析，P<0.05為差異有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義?！　?結(jié)果:　　 1、SAP6h、12h和18h組，SAP-AG6h、12h和18組及NC組七組血清ALT、AST、AMY水平總的比較差異有顯著性（P=0.000）。與NC組比較，SAP組與SAP-AG組AMY、ALT、AST水平升高，差異有顯著性（P=0

14、.000）；與SAP組相比，SAP-AG各組血清AMY、ALT、AST水平下降，差異有顯著性（P=0.000）；?！　?2、光鏡下，SAP組胰腺和肝組織病理損害程度隨時間明顯加重，與SAP組相比，SAP-AG組對應(yīng)時間點胰腺病變程度有所減輕，而肝組織損傷程度也有所減輕?！　?3、免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，SAP組和SAP-AG組中JAK2蛋白在肝臟組織中較NC組有所增多，而SAP-AG組較SAP組JAK2蛋白在肝組織中的表達

15、有所減少。　　 4、SAP6h、12h和18h組，SAP-AG6h、12h和18組及NC組七組JAK2蛋白表達總的比較差異有顯著性（P=0.000）。Western blotting結(jié)果顯示，SAP組各時間點JAK2蛋白表達顯著升高，與NC組相比差異有顯著性（P=0.000）；SAP-AG組各時間點JAK2蛋白較SAP組顯著減少，差異有顯著性（P=0.000）。 結(jié)論: 1、SAP發(fā)生后，AMY、ALT、AST水

16、平均顯著升高；組織病理學(xué)檢查顯示SAP各組大鼠胰腺組織出現(xiàn)大片的出血、壞死、炎性細胞浸潤；而肝臟組織出現(xiàn)匯管區(qū)炎性細胞浸潤、點片狀壞死等改變，且病變均隨時間的延長而進行性加重?！　?2、JAK2蛋白在SAP時高度表達，并參與了SAP的病理過程，JAK/STAT通路活化可能促進SAP肝損傷?！　?3、AG490可顯著減輕SAP肝損傷，其可能是通過抑制JAK2蛋白的表達，抑制JAK/STAT信號通路激活，從而對SAP起到治療