P物質(zhì)在大鼠急性胰腺炎肝損傷中的作用.pdf

1、急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是臨床上常見的急腹癥之一，常常并發(fā)肝、腎、肺、腸道等胰外器官損傷。AP肝損傷的機(jī)制仍未完全闡明，目前的研究認(rèn)為與炎性細(xì)胞因子、肝細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、微循環(huán)障礙等多種因素有關(guān)，是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程。 P物質(zhì)(substance P)是神經(jīng)肽中速激肽家族的重要成員，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及周圍神經(jīng)系統(tǒng)，具有痛覺傳導(dǎo)、神經(jīng)源性炎癥、內(nèi)臟平滑肌收縮及血管擴(kuò)張等許多生物學(xué)活性。P

2、物質(zhì)在調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞的游走中具有重要作用，可引起中性粒細(xì)胞的趨化以及白細(xì)胞介素8(IL-8)的合成與釋放，同時(shí)還可引起肥大細(xì)胞釋放組胺，從而促成炎癥反應(yīng)發(fā)生，是神經(jīng)纖維與炎性細(xì)胞間相互作用的介質(zhì)。P物質(zhì)與神經(jīng)激肽受體1(neurokinin receptor,NK-1R)親合力最強(qiáng)，因而NK-1R又稱為P物質(zhì)受體。NK-1R在神經(jīng)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、以及炎性細(xì)胞(如淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞)的細(xì)胞膜上表達(dá)。P物質(zhì)與N

3、K-1R結(jié)合后，可以抑制胰腺外分泌，減輕各種消化酶對(duì)胰腺及胰周組織的損害。但同時(shí)還引起血管擴(kuò)張、白細(xì)胞黏附血管壁并游出血管外、血漿外滲等反應(yīng)。P物質(zhì)引起的反應(yīng)實(shí)質(zhì)上是機(jī)體對(duì)外界有害刺激的防御反應(yīng)，但過分劇烈則產(chǎn)生不良后果。AP患者肝功能異常率高，肝功能的損害程度與AP病情呈正相關(guān)，而一旦發(fā)生肝衰竭則預(yù)后不良。研究P物質(zhì)在急性胰腺炎肝損傷時(shí)的作用對(duì)揭示AP肝損傷機(jī)制和提供治療思路具有一定的意義。目的： 研究通過建立大鼠AP模型，并

4、給予NK-1R拮抗劑L-703,606干預(yù)，觀察肝臟中P物質(zhì)、NK-1R的表達(dá)以及肝細(xì)胞凋亡的情況，探討P物質(zhì)在AP肝損傷中的作用，探討NK-1R拮抗劑對(duì)AP肝損傷的治療作用。 方法： 1.動(dòng)物模型的制備：選取Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠，以10％水合氯醛腹腔注射麻醉，取上腹正中作切口進(jìn)入腹腔，以4號(hào)手術(shù)線結(jié)扎近肝門端胰膽管，然后用4號(hào)加工鈍頭頭皮靜脈針于十二指腸乳頭附近逆行插入胰膽管，以0.2ml/mi

5、n速度注入5％牛磺膽酸鈉(0.1ml/100g)，推藥后以左手拇指按緊胰膽管入十二指腸處，觀察3min，待胰腺出現(xiàn)明顯充血后，剪去結(jié)扎線，關(guān)腹。 2.實(shí)驗(yàn)分組：將雄性SD大鼠54只，隨機(jī)分為假手術(shù)組(SO group，n=18)、AP模型組(AP group，n=18)、AP+L-703,606組(AP+L-703,606 group，n=18)，后以不同時(shí)間點(diǎn)3h、6h、12h分為3個(gè)亞組。其中AP+L-703,606組于造模

6、前15min腹腔內(nèi)注射L-703,606(250nmol/kg)。 3.生化指標(biāo)測(cè)定：取血清樣本，采用全自動(dòng)血清生化分析儀檢測(cè)血清淀粉酶、脂肪酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanineaminotransferase，ALT)由河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院生化室協(xié)助測(cè)定。 4 肝臟和胰腺組織學(xué)檢查：采用石蠟切片，HE染色。 5 肝臟P物質(zhì)和NK-1R的免疫組織化學(xué)染色：石蠟切片脫蠟至水，抗原熱修復(fù)，3％過氧化氫孵育15min，山羊血

7、清封閉30min，滴加一抗4℃過夜。陰性對(duì)照用PBS代替一抗。先后滴加二抗、三抗各15min，后用3，3-二氨基苯聯(lián)胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染后封片。以細(xì)胞漿內(nèi)呈現(xiàn)黃褐色顆粒為陽性表達(dá)。 6 凋亡測(cè)定：采用TUNEL檢測(cè)試劑盒檢測(cè)肝細(xì)胞的凋亡。 結(jié)果： 1.大鼠胰腺的病理學(xué)變化：肉眼和光鏡所見SO組胰腺及周圍組織結(jié)構(gòu)始終大致正常；AP組和AP+L-703,606組，胰腺及周圍組織水腫、出血、壞死，且隨時(shí)間延長(zhǎng)損傷程度逐

8、漸加重，腹水和中性粒細(xì)胞也逐漸增多； 2.大鼠肝臟的病理學(xué)變化：肉眼和光鏡所見SO組肝臟組織結(jié)構(gòu)始終正常；AP組和AP+L-703,606組隨時(shí)間推移，肝細(xì)胞腫脹、變性、壞死和肝索結(jié)構(gòu)解離破壞的范圍逐漸增大，程度逐漸加重，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)也增多。但AP+L-703,606組較AP組肝臟組織的損傷程度較輕。 3.血清淀粉酶的變化：在各時(shí)間點(diǎn)，SO組無明顯變化，AP組和AP+L-703,606組與SO組比較均顯著升高(P＜0.0

9、1)。AP組和AP+L-703,606組間無差異。 4 血清脂肪酶的變化：在各時(shí)間點(diǎn)，SO組無明顯變化，AP組和AP+L-703,606組與SO組比較均顯著升高(P＜0.05)。AP組和AP+L-703,606組間無差異。 5 血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶的變化：各時(shí)間點(diǎn)，SO組無明顯變化，AP組和AP+L-703,606組與SO組比較均顯著升高(P＜0.05)。AP組和AP+L-703,606組間無差異，但AP+L-703,606組

10、各時(shí)間點(diǎn)均低于AP組。 6 肝臟P物質(zhì)變達(dá)的變化：SO組，有散在分布的P物質(zhì)表達(dá)于肝細(xì)胞胞漿內(nèi)，成棕黃色顆粒。AP組和AP+L-703,606組，均有較強(qiáng)的表達(dá)。免疫組化評(píng)分顯示AP+L-703,606組表達(dá)強(qiáng)度低于AP組。 7 肝臟NK-1R表達(dá)的變化：SO組，NK-1R表達(dá)于肝細(xì)胞胞漿，染色為棕黃色顆粒。AP組和AP+L-703,606組表達(dá)均強(qiáng)于SO組。免疫組化評(píng)分顯示AP+L-703,606組表達(dá)較AP組弱。 8

11、 肝細(xì)胞凋亡的變化：SO組幾乎沒有陽性細(xì)胞表達(dá)，AP組和AP+L-703,606組均可見細(xì)胞核呈棕黃色染色的陽性細(xì)胞，且隨時(shí)間延長(zhǎng)數(shù)量增加。但AP+L-703,606組數(shù)量少于AP組。 結(jié)論： 1.逆行膽胰管內(nèi)注射5％?；悄懰徕c，血清淀粉酶、脂肪酶升高，胰腺組織HE染色觀察到胰腺及周圍組織水腫、出血和壞死等表現(xiàn)，證實(shí)大鼠AP模型制備成功。 2.AP組和AP+L-703,606組大鼠血清ALT均明顯升高，HE巳染色

12、觀察到肝臟組織結(jié)構(gòu)破壞，肝細(xì)胞變性、壞死，TUNEL檢測(cè)到明顯的肝細(xì)胞凋亡，說明AP時(shí)大鼠肝臟出現(xiàn)損傷。 3.AP大鼠肝臟組織中P物質(zhì)及其受體NK-1R表達(dá)增加，表明P物質(zhì)與AP肝損傷有密切聯(lián)系。 4 L-703,606是NK-1R的特異性拮抗劑，它通過阻斷P物質(zhì)與NK-1R結(jié)合抑制P物質(zhì)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。給予L-703,606后P物質(zhì)和NK-1R表達(dá)降低，血清ALT降低，肝細(xì)胞凋亡減少，肝臟組織損傷減輕。因此認(rèn)為，AP時(shí)